熒光檢測器工作原理及特點

　　熒光檢測器簡介

　　熒光檢測器是高壓液相色譜儀常用的一種檢測器。靈敏度在目前常用的HPLC檢測器中最高，在HPLC中應(yīng)用較多。它用于能激發(fā)熒光的化合物，極高靈敏度和良好選擇性是它最大的優(yōu)點，因而在某些領(lǐng)域如藥物和生化分析中起著不可替代的作用。

　　熒光檢測器工作原理

　　熒光檢測器的工作原理是：用紫外光照射某些化合物時它們可受激發(fā)而發(fā)出熒光，測定發(fā)出的熒光能量即可定量。

　　很多與生命科學(xué)有關(guān)的物質(zhì)，如氨基酸、胺類、維生素、甾族化合物及某些代謝藥物都可以用熒光法檢測。熒光檢測器在生物樣品痕量分析中很有用，尤其在用熒光衍生劑后，可以檢測很微量的氨基酸和肽。

　　熒光檢測器特點

　　1、靈敏度極高

　　熒光檢測器的靈敏度比紫外-可見光檢測器的靈敏度約高兩個數(shù)量級，最小檢測量可達10^（-13g）。這是因為在紫外吸收檢測法中，被檢測的信號A=lg（Io/I），即當(dāng)樣品濃度很低時，檢測器所檢測的是兩個較大信號Io及I的微小差別；而在熒光檢測法中，被檢測的是疊加在很小背景上的熒光強度。熒光檢測器是最靈敏的液相色譜檢測器，特別適合于痕量分析。愈是常用的衡量檢測器靈敏度的基準物質(zhì)。另外，熒光檢測器的靈敏度還可以用水的拉曼譜帶的信噪比來衡量。

　　2、良好的選擇性

　　產(chǎn)生熒光的一個必要條件是該物質(zhì)的分子具有能吸收激發(fā)光能量的吸收帶，即物質(zhì)分子具有一定的吸收結(jié)構(gòu)；另外的條件是吸收了激發(fā)光能量之后的分子具有高的熒光效率。相對較少的分子具有大的足夠檢測的量子效率是熒光檢測器高選擇性的主要原因。在很多情況下，熒光檢測器的高選擇性能夠避免不發(fā)熒光的成分的干擾，成為熒光檢測的獨特優(yōu)點。圖4-5-12， 中雖然紫外# 可見光檢測器在265nm可以檢測牛奶中的維生素B2，但卻取激發(fā)波長265nm，發(fā)射波長520nm做熒光檢測。因為基體成分在此條件下不存在干擾熒光，具有更準確的檢測結(jié)果。

　　3、線性范圍較寬

　　線性范圍約！$* 6 ！$+，雖然比紫外吸收檢測器窄，但對大多數(shù)痕量分析，該線性范圍已足夠?qū)?。在分析物質(zhì)濃度較大時，發(fā)射強度由于內(nèi)濾效應(yīng)可能隨濃度增加而降低。

　　4、受外界條件的影響較小

　　5、只要選作流動相的溶劑不會發(fā)射熒光，熒光檢測器就能適用于梯度洗脫。

　　其中，熒光檢測器的極高靈敏度和良好選擇性是它最大的優(yōu)點，因而在某些領(lǐng)域如藥物和生化分析中起著不可替代的作用。

　　熒光檢測器的優(yōu)缺點

　　優(yōu)點：

　?、凫`敏度極高。熒光檢測器的靈敏度比紫外-可見光檢測器的靈敏度約高兩個數(shù)量級，最小檢測量可達10^（-13g）。這是因為在紫外吸收檢測法中，被檢測的信號A=lg（Io/I），即當(dāng)樣品濃度很低時，檢測器所檢測的是兩個較大信號Io及I的微小差別；而在熒光檢測法中，被檢測的是疊加在很小背景上的熒光強度。熒光檢測器是最靈敏的液相色譜檢測器，特別適合于痕量分析。愈是常用的衡量檢測器靈敏度的基準物質(zhì)。另外，熒光檢測器的靈敏度還可以用水的拉曼譜帶的信噪比來衡量。

　?、诹己玫倪x擇性。產(chǎn)生熒光的一個必要條件是該物質(zhì)的分子具有能吸收激發(fā)光能量的吸收帶，即物質(zhì)分子具有一定的吸收結(jié)構(gòu)；另外的條件是吸收了激發(fā)光能量之后的分子具有高的熒光效率。相對較少的分子具有大的足夠檢測的量子效率是熒光檢測器高選擇性的主要原因。在很多情況下，熒光檢測器的高選擇性能夠避免不發(fā)熒光的成分的干擾，成為熒光檢測的獨特優(yōu)點。

　?、劬€性范圍較寬。雖然比紫外吸收檢測器窄，但對大多數(shù)痕量分析，該線性范圍已足夠?qū)?。在分析物質(zhì)濃度較大時，發(fā)射強度由于內(nèi)濾效應(yīng)可能隨濃度增加而降低。

　?、苁芡饨鐥l件的影響較小。

　?、葜灰x作流動相的溶劑不會發(fā)射熒光，熒光檢測器就能適用于梯度洗脫。

　　缺點：

　　①熒光檢測器的高選擇性優(yōu)點在一些情況下，也是該檢測器的缺點。因為不是所有的化合物在選擇的條件下都能發(fā)生熒光，所以熒光檢測器不屬于通用型檢測器，與紫外-可見光檢測器相比，應(yīng)用范圍較窄。

　?、趯νǔ０l(fā)生在熒光測量中的一些干擾非常敏感，如背景熒光和猝滅效應(yīng)等。雖然這些干擾在液相分析中不經(jīng)常遇到，但在進行定量分析時，有必要驗證這些干擾是否存在，以及對樣品測定的影響程度。尤其對某些物質(zhì)，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子及硝基化合物等，都應(yīng)予以特別注意。

　　熒光檢測器的應(yīng)用

　　1、用于食品工業(yè)、化妝品制造業(yè)、醫(yī)療單位衛(wèi)生監(jiān)測。

　　2、配合專用試劑，可對測液體、固體食品、表面等微生物總數(shù)做快速評估。

　　熒光檢測器的使用

　　1、將熒光劑按一定比例加入到系統(tǒng)內(nèi)，加入熒光劑后向系統(tǒng)內(nèi)補充適量的冷媒以便把熒光劑安全推入系統(tǒng)內(nèi)。

　　2、系統(tǒng)運行20分鐘以后便可戴上專用眼鏡，用檢漏儀照射系統(tǒng)的外部，泄漏點呈明亮的黃色。

　　3、如漏點極小，建議你隔一天用紫光燈仔細檢查系統(tǒng)管路。

　　4、如果有些地方看不到，你可以用一個反光鏡，放在要檢查的地方，用紫光燈照射反光鏡，就可以看到隱蔽地方是否泄漏，也可以用一塊干凈的抹布擦一下懷疑泄漏的地方，然后用紫光燈照射抹布看是否有熒光劑存在。

　　5、復(fù)檢時應(yīng)注意：維修好滲漏點，應(yīng)清洗殘留在系統(tǒng)外部的熒光劑，運行系統(tǒng)后，用熒光燈檢查已維修部位，以確保滲漏已經(jīng)修好。