微流控芯片技術(shù)詳解_微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

　　微流控芯片技術(shù)（Microfluidics）是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上， 自動(dòng)完成分析全過(guò)程。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域。

　　本文首先介紹了微流控技術(shù)原理及微流控芯片的工作原理，其次詳細(xì)的闡述了微流控芯片技術(shù)，最后介紹了微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，具體的跟隨小編一起來(lái)了解一下。

　　微流控技術(shù)原理

　　微流控（microfluidics ）是一種精確控制和操控微尺度流體，以在微納米尺度空間中對(duì)流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)，具有將生物、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室的基本功能諸如樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等縮微到一個(gè)幾平方厘米芯片上的能力，其基本特征和最大優(yōu)勢(shì)是多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺(tái)上靈活組合、規(guī)模集成。是一個(gè)涉及了工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、微加工和生物工程等領(lǐng)域的交叉學(xué)科。

　　微流控是系統(tǒng)的科學(xué)技術(shù)，它使用幾十到幾百微米尺度的管道，處理或操控很少量的（10*至10~18升，1立方毫米至1立方微米） 流體。最初的微流控技術(shù)被用于分析。微流控為分析提供了許多有用的功能： 使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測(cè)，費(fèi)用低，分析時(shí)間短，分析設(shè)備的印記小。微流控既利用了它最明顯的特征一一尺寸小，也利用了不太明顯的微通道流體的特點(diǎn)，比如層流。它本質(zhì)上提供了在空間和時(shí)間上集中控制分子的能力。

　　微流控芯片的工作原理

　　微流控芯片采用類似半導(dǎo)體的微機(jī)電加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)，將實(shí)驗(yàn)與分析過(guò)程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上，加載生物樣品和反應(yīng)液后，采用微機(jī)械泵。電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動(dòng)芯片中緩沖液的流動(dòng)，形成微流路，于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)。激光誘導(dǎo)熒光、電化學(xué)和化學(xué)等多種檢測(cè)系統(tǒng)以及與質(zhì)譜等分析手段結(jié)合的很多檢測(cè)手段已經(jīng)被用在微流控芯片中，對(duì)樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高通量分析。微流控芯片的最大特點(diǎn)是在一個(gè)芯片上可以形成多功能集成體系和數(shù)目眾多的復(fù)合體系的微全分析系統(tǒng)？微型反應(yīng)器是芯片實(shí)驗(yàn)室中常用的用于生物化學(xué)反應(yīng)的結(jié)構(gòu)，如毛細(xì)管電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、酶反應(yīng)和DNA 雜交反應(yīng)的微型反應(yīng)器等。其中電壓驅(qū)動(dòng)的毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE） 比較容易在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)，因而成為其中發(fā)展最快的技術(shù)。它是在芯片上蝕刻毛細(xì)管通道，在電滲流的作用下樣品液在通道中泳動(dòng)，完成對(duì)樣品的檢測(cè)分析，如果在芯片上構(gòu)建毛細(xì)管陣列，可在數(shù)分鐘內(nèi)完成對(duì)數(shù)百種樣品的平行分析。

　　微流控芯片技術(shù)詳解

　　1、微流控芯片的基質(zhì)材料

　　基質(zhì)材料是微流控芯片的載體，在微流控芯片發(fā)展的初期，硅材料作為構(gòu)建微流控芯片的首選材料而被廣泛使用，這主要?dú)w因于業(yè)已成熟的半導(dǎo)體技術(shù)。但是隨著研究的不斷深入和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，它表現(xiàn)出了不同程度的局限性：硅材料屬于半導(dǎo)體，不能承受高電壓，此外，硅材料不透明，與光學(xué)檢測(cè)技術(shù)不兼容。

　　玻璃材料具有很好的電滲性質(zhì)和優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì)，無(wú)論是從其物理性質(zhì)還是化學(xué)性質(zhì)來(lái)講，都非常適合于微流控芯片的制作，但是它的光刻和蝕刻技術(shù)工藝復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，制作成本過(guò)高，這些因素制約了玻璃微流控芯片的應(yīng)用和推廣。

　　因此，研究者們開始把更多的注意力轉(zhuǎn)向了原材料便宜、加工制作簡(jiǎn)單的高分子聚合物，目前，以聚二甲基硅氧烷（PolydiMethyl-Siloxane，PDMS）為代表的有機(jī)高分子聚合物已成為微流控芯片研究的熱點(diǎn)，PDMS表現(xiàn)出了非常理想的材料特性：良好的絕緣性，能承受高電壓，已廣泛應(yīng)用于各種毛細(xì)管電泳微芯片的制作；熱穩(wěn)定性高，適合加工各種生化反應(yīng)芯片；具有很高的生物兼容性和氣體通透性，可以用于細(xì)胞培養(yǎng)；同時(shí)具有優(yōu)良的光學(xué)特性，可應(yīng)用于多種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)；彈性模量低，適合于制作微流體控制器件，如泵膜等。此外，PDMS還可以和硅、氮化硅、氧化硅、玻璃等許多材料形成很好的密封。此外，較常用的高分子聚合物還包括聚甲基丙烯酸甲酯（PolyMethylMethAcrylate，PMMA）、聚碳酸酯（PolyCarbonate，PC）等。

　　2、微流控芯片的加工技術(shù)

　　微細(xì)加工技術(shù)是微流控芯片發(fā)展的前提條件，微流控芯片的制作技術(shù)首先起源于制造半導(dǎo)體及集成電路芯片所廣泛采用的光刻（Lithography）和蝕刻技術(shù)（Etching），目前已經(jīng)廣泛地用于硅片、玻璃和石英等基質(zhì)材料上微流體網(wǎng)絡(luò)的制作。其微制造工藝為：首先通過(guò)光學(xué)制板照相技術(shù)制備包括微流控芯片圖案的掩模，制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板；然后用甩膠機(jī)均勻地在芯片表面涂敷一層光刻膠，在紫外光下進(jìn)行曝光，顯影。上述工作完成之后，用相應(yīng)的腐蝕劑對(duì)芯片進(jìn)行蝕刻，蝕刻完成后，去除剩余的光刻膠便可獲得所需的芯片微細(xì)結(jié)構(gòu)。該方法工藝周期長(zhǎng)、制作成本高，但其微加工技術(shù)非常成熟。

　　與硅片、玻璃材料不同的是，可用于微流控芯片加工制作的高分子聚合物種類繁多，而且各材料之間的物理化學(xué)性質(zhì)差別很大，所以它們的微加工技術(shù)表現(xiàn)出了一定的多樣性，目前主要有模塑法、熱壓法、LIGA技術(shù)、激光燒蝕技術(shù)和軟光刻法等。

　　a、模塑法（Injection Molding）

　　是指通過(guò)光刻掩模技術(shù)制得凸起的微流控芯片陽(yáng)模，然后在陽(yáng)模上澆注液態(tài)的高分子聚合物，當(dāng)高分子聚合物完全固化后將其與陽(yáng)模剝離即可得到具有微流體網(wǎng)絡(luò)的基片，適宜采用模塑法的高分子材料應(yīng)該具有很低的黏度和很低的固化溫度，如PDMS，環(huán)氧樹脂，聚四氟乙烯等材料。

　　b、熱壓法

　　也是一種需要陽(yáng)模的微流控芯片制造技術(shù)，該技術(shù)主要利用了高分子聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。與模塑法相比，熱壓法制得的微通道重復(fù)性較差，而且管道易產(chǎn)生變形，操作條件相對(duì)苛刻。該方法主要應(yīng)用于熱塑性材料的加工，如PMMA和PC等。

　　c、激光燒蝕（Laser Ablation）

　　是一種新型的微細(xì)加工技術(shù)，它是通過(guò)紫外激光降解高分子聚合物，適宜激光燒蝕加工的材料有PMMA、聚苯乙烯、硝化纖維等。

　　3、微流控芯片的微流體控制技術(shù)

　　微流體操縱技術(shù)是微流控芯片技術(shù)中最重要的一個(gè)研究領(lǐng)域之一，通過(guò)各種機(jī)械或非機(jī)械力實(shí)現(xiàn)對(duì)流體的驅(qū)動(dòng)和控制。依據(jù)微流體驅(qū)動(dòng)體系中有無(wú)機(jī)械活動(dòng)部件，可以將其分為機(jī)械和非機(jī)械驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)。

　　a、機(jī)械驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

　　主要包括壓電微泵、靜電微泵等，它主要是通過(guò)靜電、壓電等不同方法來(lái)觸發(fā)引起的機(jī)械部件的運(yùn)動(dòng)，從而為微流體提供動(dòng)力源，這種泵的優(yōu)點(diǎn)是任何流體都可以推動(dòng)，但其所驅(qū)動(dòng)的流體呈脈沖狀而不是連續(xù)式的。

　　b、非機(jī)械驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

　　主要包括電滲泵、熱毛細(xì)管泵等，其中電滲泵是微流控芯片系統(tǒng)中最常用的一種驅(qū)動(dòng)力，相對(duì)于微機(jī)械壓力驅(qū)動(dòng)的泵來(lái)說(shuō)，電滲泵有很多優(yōu)點(diǎn)：如電滲泵易于制作而且沒有任何移動(dòng)部件，電滲泵的樣品柱只有少量的擴(kuò)散，此外，可以采用改變微通道壁x（電勢(shì)）的方法來(lái)進(jìn)一步控制電滲流的量和方向。

　　4、微流控芯片檢測(cè)技術(shù)

　　微流控芯片的結(jié)構(gòu)特征決定了其檢測(cè)技術(shù)的特殊性，與傳統(tǒng)檢測(cè)儀器相比，微流控芯片對(duì)其檢測(cè)系統(tǒng)提出了更高的要求，如要求靈敏度高、響應(yīng)速度快、具有平行分析功能和便攜式特征等，目前基于不同原理的很多檢測(cè)技術(shù)都已經(jīng)應(yīng)用到微流控芯片的研究中，主要有光學(xué)檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、質(zhì)譜等方法。

　　a、光學(xué)檢測(cè)

　　光學(xué)檢測(cè)是微流控芯片檢測(cè)方法中應(yīng)用最廣的一種，其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，且檢測(cè)器與分析對(duì)象不需直接接觸。其中激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)（Laser Induced Fluorescence，LIF）是目前最靈敏的檢測(cè)方法之一，其靈敏度達(dá)到10-9mol/L~10-12mol/L，對(duì)于某些熒光效率高的分子，其檢測(cè)能力可以達(dá)到單分子水平，因此它也是當(dāng)前商品化微流控系統(tǒng)中唯一被采用的檢測(cè)器。但該檢測(cè)設(shè)備價(jià)格昂貴，而且體積龐大，與微尺寸的微流控芯片極不匹配，一定程度上限制了其廣泛推廣與應(yīng)用。

　　b、電化學(xué)檢測(cè)

　　基于電化學(xué)檢測(cè)原理的檢測(cè)系統(tǒng)可以說(shuō)是最完整的、最集成、最理想的芯片檢測(cè)系統(tǒng)之一，這主要有兩方面的原因：一方面，微電極的制造技術(shù)與當(dāng)前微流控芯片的加工工藝是完全兼容的，可以實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)；另一方面，電化學(xué)檢測(cè)具有靈敏度高、選擇性好、不受光程和樣品渾濁度影響等優(yōu)點(diǎn)，且只需要極少的外圍輔助設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，圖1給出的是一種便攜式電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)。無(wú)疑，基于電化學(xué)原理的芯片檢測(cè)技術(shù)代表未來(lái)芯片檢測(cè)器的一個(gè)重要發(fā)展方向，顯示了巨大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

　　c、質(zhì)譜檢測(cè)

　　質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)作為生物化學(xué)分析的重要手段，由于能夠提供試樣組分中生物大分子的基本結(jié)構(gòu)和定量信息，所以在微流控芯片檢測(cè)器中表現(xiàn)出了巨大潛力，但當(dāng)前質(zhì)譜檢測(cè)的瓶頸在于質(zhì)譜儀與微流控芯片的接口問題。

　　微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

　　從微流控芯片的分析性能看，其未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑹謴V泛，并且其應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷地拓展之中，但目前的重點(diǎn)顯然是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。除此之外，高通量藥物合成與篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生、刑事科學(xué)及國(guó)防等方面也會(huì)成為重要的應(yīng)用領(lǐng)域?，F(xiàn)僅就微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用舉三個(gè)例子說(shuō)明微流控芯片系統(tǒng)的巨大潛力：

　　1、毛細(xì)管電泳分離

　　毛細(xì)管電泳芯片是微流控芯片中發(fā)展最早、也是發(fā)展最快的一項(xiàng)芯片技術(shù)，目前已經(jīng)成為微流控芯片領(lǐng)域中最令人矚目的一個(gè)分支。與傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳相比，它具有自動(dòng)化程度高、樣品消耗少、分析速度快以及高通量等特征，在對(duì)DNA片段、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子的分析中，它表現(xiàn)出了超強(qiáng)的分離分析能力，它被認(rèn)為是后基因時(shí)代中最有希望攻克蛋白質(zhì)研究、基因臨床診斷等科學(xué)難題的分離分析手段之一。

　　1992年Manz A發(fā)表了第一篇有關(guān)毛細(xì)管電泳芯片的論文，該文以熒光染料為分析對(duì)象，以電滲流作為流體驅(qū)動(dòng)力，在芯片微流體網(wǎng)絡(luò)中成功地實(shí)現(xiàn)了流體控制，向人們展示了毛細(xì)管電泳芯片的雛形和其優(yōu)越的分離分析能力，這一研究成果引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注和興趣，相繼各種用于氨基酸、蛋白質(zhì)、藥物等分離的芯片也不斷開發(fā)成功。為了進(jìn)一步提高芯片的分析能力，Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組最近在直徑為200mm的圓盤玻璃芯片上集成384個(gè)毛細(xì)管電泳微通道，其有效分離長(zhǎng)度達(dá)到了8cm，對(duì)100bp（base pair，堿基對(duì)）~1000bp的基因標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物達(dá)到了優(yōu)于10bp的分辨率，并在該芯片上完成了1163D變異基因的PCR-RFLP（限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）分析，為臨床診斷提供了依據(jù)。

　　毛細(xì)管電泳微芯片是微流控分析芯片中產(chǎn)業(yè)化程度最高、也是最先實(shí)現(xiàn)商品化的一類芯片，早在1999年，美國(guó)惠普（現(xiàn)為安捷倫）與Caliper Tech-nologies公司聯(lián)合研制的第一臺(tái)微流控芯片商品“2100生化分析儀”就已經(jīng)開始投放市場(chǎng)，該系統(tǒng)使用CAliper公司生產(chǎn)的玻璃芯片，采用LIF進(jìn)行檢測(cè)，并配了5~6種試劑盒配合使用，可對(duì)DNA、RNA片段及蛋白質(zhì)等進(jìn)行電泳分離檢測(cè)，玻璃芯片尺寸為1.8cm×1.8cm，有效分離長(zhǎng)度約1.6cm，30min可同時(shí)完成12個(gè)樣的分離檢測(cè)。與傳統(tǒng)的基因和蛋白質(zhì)電泳相比，芯片毛細(xì)管電泳無(wú)需樣品的走膠、染色、脫色工序，無(wú)需干燥和照相等煩瑣耗時(shí)的步驟，同時(shí)快速測(cè)試多個(gè)試樣，獲得基因和蛋白質(zhì)的電泳圖和曲線。整個(gè)測(cè)試過(guò)程簡(jiǎn)化為快速、簡(jiǎn)易的三個(gè)步驟：裝載樣品、進(jìn)行分析、觀察數(shù)據(jù)。

　　2、基因測(cè)序

　　毛細(xì)管電泳的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域是基因測(cè)序，正是因?yàn)?6根毛細(xì)管電泳陣列儀廣泛地應(yīng)用于人類基因組計(jì)劃的測(cè)序工作之中，才使舉世矚目的人類基因組計(jì)劃的進(jìn)程大大加快，使之由原定的2003年提前到2000年基本完成。事實(shí)上，從基因測(cè)序的原理來(lái)講，芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序和普通毛細(xì)管電泳測(cè)序是完全一致的，但前者表現(xiàn)出了更大的優(yōu)越性：首先由于芯片毛細(xì)管電泳獨(dú)特的注樣方式和更細(xì)的分離通道，所以它能實(shí)現(xiàn)DNA的快速分離；另一方面微流控芯片采用了半導(dǎo)體工業(yè)中成熟的微加工技術(shù)進(jìn)行制造，所以一塊芯片上可以集成更多的毛細(xì)管，實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序；最后由于它實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物處理和分析的集成化，減少了人為干擾，因此更進(jìn)一步地降低了操作成本。

　　Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組早在1995年就開始在微流控芯片上開展了DNA測(cè)序工作，他們?cè)谝粔K有效分離長(zhǎng)度為3.5cm的芯片上測(cè)序了150個(gè)堿基，他們利用芯片變性毛細(xì)管電泳在10min之內(nèi)就完成了對(duì)433個(gè)堿基序列的測(cè)定。該測(cè)序芯片的毛細(xì)管長(zhǎng)度為3.5cm，橫切面尺寸50μm×8μm。為了進(jìn)一步提高DNA測(cè)序能力，到2001年他們?cè)谥睆綖?50mm的圓形玻璃芯片上，刻蝕出了96個(gè)呈輻射型排布的毛細(xì)管電泳通道陣列，由于芯片采用旋轉(zhuǎn)掃描LIF法進(jìn)行檢測(cè)，所以可實(shí)現(xiàn)平行測(cè)序，測(cè)序達(dá)500堿基。

　　3、PCR反應(yīng)

　　生化反應(yīng)芯片的功能就是把在普通實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)縮微到一塊小小的芯片上來(lái)完成。目前報(bào)道的生化反應(yīng)芯片主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerize Chain Reaction，PCR）芯片、藥物合成芯片等，其中PCR芯片是生化反應(yīng)芯片的典型代表。眾所周知，常規(guī)PCR需要制樣、擴(kuò)增及檢測(cè)等步驟，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，而當(dāng)用微流控芯片進(jìn)行PCR擴(kuò)增及相關(guān)檢測(cè)時(shí)，則可大大簡(jiǎn)化操作步驟、顯著提高檢測(cè)效率。1993年Northrup等人以硅片和玻璃為基質(zhì)材料首次報(bào)道了一種PCR芯片，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了PCR芯片可行性。該芯片的反應(yīng)室刻蝕在硅片中，體積約為幾微升，加熱器也直接集成在芯片上，與傳統(tǒng)的PCR相比，在相同擴(kuò)增效率下，該芯片的熱循環(huán)效率快2~ 10倍。為了進(jìn)一步提高PCR芯片的熱循環(huán)速度，Kopp M U等人發(fā)展了一種連續(xù)流動(dòng)式的PCR芯片，流動(dòng)式芯片下面有95℃、72℃、60℃三個(gè)不同的恒溫區(qū)間，當(dāng)樣品流經(jīng)它們時(shí)就會(huì)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)變溫，在流動(dòng)中完成變性、退火和延伸反應(yīng)，達(dá)到PCR擴(kuò)增的目的。

　　另外，一旦把PCR芯片與毛細(xì)管電泳芯片二者集成起來(lái)的時(shí)候，其優(yōu)勢(shì)就顯得更為明顯。Lagally E T等人在玻璃芯片上制作了集閥門、疏水孔、PCR反應(yīng)池以及毛細(xì)管電泳（Capillary Elec-trophoresis，CE）于一體的芯片系統(tǒng)，PCR反應(yīng)池體積是280nL，PCR擴(kuò)增前所需模板濃度為20拷貝/mL，反應(yīng)室中平均僅為5~6個(gè)DNA模板分子，加熱器和熱電偶集成在芯片的背面，10min即可完成20個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，PCR反應(yīng)產(chǎn)物在電滲泵的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入毛細(xì)管電泳芯片中，進(jìn)行在線CE分離分析。該芯片系統(tǒng)集取樣、PCR擴(kuò)增和CE分離于一體，節(jié)省了試劑消耗、加快了分析速度，同時(shí)也避免了實(shí)驗(yàn)操作中的人為污染。