利用微流控芯片高通量收集血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測癌癥

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC，CirculatingTumor Cell）是存在于外周血中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱，因自發(fā)或診療操作從實體腫瘤病灶（原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶）脫落，大部分CTC在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險。

原發(fā)腫瘤細(xì)胞脫落或轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞

因此CTC的檢測具有重要的預(yù)后和治療意義，但由于其數(shù)量可能非常少，因此不容易檢測到這些細(xì)胞。據(jù)估計，在已經(jīng)脫離原發(fā)腫瘤的細(xì)胞中，只有0.01%能夠形成轉(zhuǎn)移。

在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的頻率約為每毫升全血1-10個CTC，而相比之下，一毫升血液中含有幾百萬白細(xì)胞和十億紅細(xì)胞。這種低頻率導(dǎo)致識別癌細(xì)胞十分困難，這意味著理解CTC生物學(xué)特性的關(guān)鍵一步是富集、純化、分離每毫升血液中極少量CTC的技術(shù)和方法。

微流控芯片利用慣性和磁力從血液中分離出循環(huán)腫瘤細(xì)胞

微流控芯片利用慣性從血液中分離出循環(huán)腫瘤細(xì)胞

為克服這一困難，來自杭州電子科技大學(xué)的科研團(tuán)隊結(jié)合高精度3D打印和軟光刻技術(shù)制造了多層微流控芯片，可用于超高通量富集和分離血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，同時能夠降低終端流速，便于后續(xù)實時阻抗和光學(xué)檢測，未來有望推動早期癌癥的血液篩查。

用于從血液中分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的三層微流控芯片

基于慣性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞收集

研究人員提出了一種用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）收集和下游分析的3D堆疊多層慣性微流控分選芯片。該芯片頂部使用梯形螺旋通道分離CTC和血紅細(xì)胞，然后中間和底部使用兩級方形蛇形通道進(jìn)一步去除RBC并純化目標(biāo)樣品溶液。

通過整合螺旋通道和蛇形通道降低流速，可以在通道收集出口處應(yīng)用各種檢測方法，例如阻抗檢測和成像。因此，多級分揀芯片可以實現(xiàn)高流量輸入和低流量輸出，滿足醫(yī)療診斷對吞吐量和檢測的要求。

基于三層微流控芯片分離CTC用于后續(xù)醫(yī)學(xué)檢測

此外，由聚二甲基硅氧烷（PDMS）鑄造的3D堆疊結(jié)構(gòu)減少了芯片面積（2cm×3cm），并具有良好的多層觀察透明度。性能方面，該3D微流控芯片能夠以1.3 mL/min的高流速從大量RBC背景細(xì)胞中分離SW480（人結(jié)腸癌細(xì)胞）、A549（人肺腺癌細(xì)胞）和Caki-1（人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞），分離效率>80%，分離純度>90%，濃度倍數(shù)約為20。

這項工作旨在提供一種可以用于快速醫(yī)學(xué)診斷的檢測方法集成的樣品處理方法。

螺旋和蛇形通道分離不同尺寸顆粒的原理和示意圖

微流控芯片設(shè)計、制造及參數(shù)優(yōu)化

該3D堆疊多級慣性微流體細(xì)胞分選芯片集成了梯形螺旋通道和兩個方形蛇形通道。梯形螺旋通道具有一個入口和兩個出口，是芯片的第一級。在梯形螺旋通道中，流速相對較高，紅細(xì)胞將集中在外壁附近，而CTC將集中在內(nèi)壁附近，進(jìn)而實現(xiàn)CTC與紅細(xì)胞的分離。不同層的通道按照液體流動方向從上到下排列，整個芯片只有一個入口，無需額外輸入鞘流。

多層微流控芯片。（a）（b）（c）分別為第一、第二和第三層。（d）三層疊加。

此外，為了確保通道的所有階段都能在最佳工作狀態(tài)下工作，還設(shè)計了匹配通道以匹配流動阻力。在自動多級去除紅細(xì)胞和目標(biāo)流的減速、聚集和濃縮后，流速從mL/min降至μL/min，這使得與下游檢測和分析（如阻抗檢測和成像分析）更容易集成。

參數(shù)優(yōu)化過程

概念驗證

概念驗證實驗可以通過分離兩種不同尺寸的聚苯乙烯微粒進(jìn)行。在只有一個單通道注射泵驅(qū)動輸入樣品的情況下，光學(xué)顯微鏡可以捕獲通道每一級出口處的分選過程。在每次測試中，將10秒的視頻數(shù)據(jù)作為圖像疊加的原始數(shù)據(jù)。然后，通過ImageJ軟件對600張圖片的垂直疊加最小化，獲得粒子軌跡。

多級通道結(jié)構(gòu)圖

基于慣性實現(xiàn)不同尺寸微顆粒的篩選。較大顆粒會保持向前流動，但較小顆粒會被兩側(cè)支線分流

組合不同通道結(jié)構(gòu)的各級出口分離效果比較

腫瘤細(xì)胞實驗

最后，研究者使用腫瘤細(xì)胞（SW480、A549和Caki-1）進(jìn)行了驗證。通過使用概念驗證實驗中所得的最佳工作流速，將配置的血細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的混合液通入多級芯片結(jié)構(gòu)，對收集口細(xì)胞情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該3D堆疊芯片可以實現(xiàn)了從大量背景細(xì)胞中分離多種類型的腫瘤細(xì)胞，分離效率>80%，分離效率>90%。

該微流控芯片能有效分離血紅細(xì)胞（RBC）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞（A549）

芯片用于CTC分選驗證（a）紅細(xì)胞與A549的混合液 （b）廢液口（c）收集口（d）SW480、A549和Caki-1在最終出口的疊加軌跡（e）三種CTC的分離效率、分離純度和濃度倍數(shù)

未來與展望

CTC作為腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是腫瘤液體活檢的主要材料之一，在腫瘤患者的預(yù)后判斷、療效預(yù)測、療效評價、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及耐藥機(jī)制的研究中都具有重要的臨床意義。

3D堆疊多級微流控芯片設(shè)計克服了現(xiàn)有單級芯片中分離純度、分離效率和吞吐量之間的限制，通過多級流速降低可為下游檢測方法的集成提供一個有效的解決方案。

該芯片所提供的樣本預(yù)處理功能能夠較好地滿足上下游檢測分析的需要，防止交叉污染、減少細(xì)胞黏附等傳統(tǒng)細(xì)胞處理方法中常見的問題，具有較廣闊的應(yīng)用場景，對于腫瘤研究具有重要意義。

審核編輯：劉清