微流體壓縮通道陣列結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)識(shí)別乳腺癌細(xì)胞

癌癥一直以來是威脅人們生命健康的首要疾病，隨著世界范圍內(nèi)科技進(jìn)步發(fā)展，自身因素導(dǎo)致的突變和外部因素誘導(dǎo)的癌癥患者數(shù)量大幅提升。目前各種抗癌藥物研發(fā)和治療手段的發(fā)展在臨床應(yīng)用上起到了一定程度的效果，但癌細(xì)胞的抗藥性和抗治療方法特性也在不斷改變。針對(duì)患者自身的癌細(xì)胞擴(kuò)散程度建立治療方案的“個(gè)性化醫(yī)療”和“精確醫(yī)療”理念也在不斷完善和發(fā)展。精確醫(yī)療需要在診斷病人癌細(xì)胞的擴(kuò)散程度和轉(zhuǎn)移能力方面達(dá)到個(gè)性化識(shí)別。

微流體技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的識(shí)別，生物物理特性檢測(cè)，以及藥物治療效果的檢測(cè)分析。很多綜述文章討論過對(duì)于微流體通道本身的制造方法和結(jié)構(gòu)的改進(jìn)，用來促進(jìn)不同種類細(xì)胞的識(shí)別和測(cè)量。這種器件可以同時(shí)處理大量樣品，同時(shí)保證達(dá)到單細(xì)胞精度，確保單個(gè)細(xì)胞通過多級(jí)的壓縮和舒張區(qū)域，達(dá)到對(duì)細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜生物機(jī)械特性的測(cè)量。在細(xì)胞檢測(cè)數(shù)據(jù)的分析方面，引入機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能算法屬于未來醫(yī)療的趨勢(shì)。在醫(yī)院診斷方面，使用人工智能算法可以綜合大量數(shù)據(jù)作為分析和學(xué)習(xí)的數(shù)據(jù)庫，可以提供更精確的數(shù)據(jù)判斷結(jié)果。

圖1：（TOC圖）微流體壓縮通道陣列識(shí)別癌細(xì)胞

微流體芯片采用光敏樹脂SU-8 3005和3025作為硅片上的光刻材料，可以制造出寬6-10微米，高8-10微米的壓縮區(qū)通道，以及寬30-40微米，高20-30微米的舒張區(qū)。首先在清潔的硅片上添加SU-83025作為第一層，使用能量為300mJ/cm2的紫外光固化。經(jīng)過SU-8洗滌清洗后干燥，再添加較厚的SU-8 3025作為第二層，使用能量為350mJ/cm2的紫外光固化，洗去不需要的結(jié)果之后，用異丙醇清洗整個(gè)硅片，同時(shí)在硅膠PDMS反向注模之前保持清潔。在確保沒有多余氣泡產(chǎn)生的情況下，PDMS在65°C 的加熱24小時(shí)，即可取下作為微流體的主要部分。經(jīng)過氧氣的等離子處理表面70秒后，可與玻璃粘合成為微流體芯片。

在壓縮區(qū)中，所有細(xì)胞都會(huì)在流體壓力的情況下發(fā)生形變，其通過速度可以有高速照相機(jī)捕捉。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入舒張區(qū)時(shí)，較容易變形的細(xì)胞，比如癌細(xì)胞，更容易恢復(fù)其原有的形狀，當(dāng)進(jìn)入下一個(gè)壓縮區(qū)時(shí)，二次形變發(fā)生的程度都會(huì)有第一次形變有所不同，表現(xiàn)為在微流體通道中，通道壁與細(xì)胞表面的切應(yīng)力發(fā)生非線性的變化，因而改變通過的速度。這一速度變化可以作為標(biāo)示生物機(jī)械特性的一組變量。如果進(jìn)入微流體通道的是正常細(xì)胞，通常正常上皮細(xì)胞有更結(jié)實(shí)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，更不容易發(fā)生形變，而在微流體壓力作用下發(fā)生形變之后，在舒張區(qū)不容易恢復(fù)其原有形態(tài)，所以可以更快地通過第二次壓縮變形，從而顯示出與癌細(xì)胞不一樣的速度分布。根據(jù)這種速度分布，我們可以總結(jié)出單個(gè)細(xì)胞的速度特性，而這種速度特性間接地表現(xiàn)出細(xì)胞結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度和楊氏模量等參數(shù)，從而間接的識(shí)別癌細(xì)胞與正常細(xì)胞。

圖2：實(shí)驗(yàn)裝置示意圖（X.Ren,et al., ACS Sensors,2017, 2 (2), 290-299）。

除此之外，對(duì)于寬度超過細(xì)胞大小的舒張區(qū)可以給細(xì)胞完全恢復(fù)原有形態(tài)的機(jī)會(huì)，我們還可以設(shè)計(jì)出相對(duì)于這種“完全舒張區(qū)”的“部分舒張區(qū)”微流體通道?，F(xiàn)有設(shè)計(jì)中30微米以上的舒張區(qū)可以改為9-12微米的部分舒張區(qū)。當(dāng)細(xì)胞在舒張區(qū)試圖恢復(fù)原有形態(tài)的時(shí)候，部分舒張區(qū)只允許細(xì)胞恢復(fù)到9-12微米的柱狀，這種形態(tài)下，不同種類的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出與完全舒張區(qū)不同的速度分布特性。對(duì)于我們使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法的項(xiàng)目，產(chǎn)生這種更獨(dú)特的速度分布數(shù)據(jù)只會(huì)更有利于最終的結(jié)果分析。尤其是針對(duì)臨床樣品的癌細(xì)胞研究，當(dāng)檢測(cè)某種特定的抗癌藥物的藥效時(shí)，盡可能精確的區(qū)分產(chǎn)生藥效的和為產(chǎn)生藥效，或者本身已經(jīng)產(chǎn)生抵抗藥物的現(xiàn)象下的癌細(xì)胞就尤為重要。采用這種多級(jí)的微流體芯片能獲取盡可能多的細(xì)胞生物機(jī)械特性數(shù)據(jù)。

圖3：（a）微流體通道示意圖；（b）采集到的細(xì)胞速度。

Kernel模型的機(jī)器學(xué)習(xí)方法可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)高維變量的大數(shù)據(jù)分析。主要采用三種方法：Ridge，NGK，和Lasso。其中Ridge和Lasso都是基于線性模型，而NGK突出非線性變量在模型中的權(quán)重。采集到的細(xì)胞生物機(jī)械特性由大量的速度變量組成，同時(shí)不同運(yùn)算下的速度變量又可以產(chǎn)生大量的高維變量。傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析在處理這樣大量的數(shù)據(jù)結(jié)果時(shí)不容易捕捉到有效變量和有效的變量?jī)?nèi)在關(guān)系，所以使用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法可以用于快速，有效地識(shí)別不同類型的細(xì)胞。

選取變量是第一步，比如間接描述生物機(jī)械特性的速度變量，在一個(gè)微流體通道中可以定義12個(gè)速度變量v1, v2, … , v12。進(jìn)一步可以定義速度變化率，比如αm,n=(vm-vn)/vn, (m=1,2,…,12; n=1,2,…,12)，這樣就可以再產(chǎn)生66個(gè)變量。

首先，將所有高維變量數(shù)據(jù)分為10組，以便于交叉運(yùn)算。首先考慮對(duì)每種細(xì)胞類型t,t=1,…,T，做n次測(cè)量，得到p個(gè)變量的數(shù)據(jù)組(y,Xt), 其中 Xt=[x1t,x2t,…,xpt],定義xjt=[xj1t,xj2t,…,xjnt]T是一個(gè)第j組的n×1的向量，有j=1,…,p.對(duì)于Ridge和Lasso，根據(jù)變量產(chǎn)生線性模型：

其中H是函數(shù)，而且有：

Ridge和Lasso分別采用L2絕對(duì)值||β||2和L1絕對(duì)值||β||，其中β=（β0,β1,…, βp）T。Ridge的目標(biāo)函數(shù)是得到下面這個(gè)方程的最小值：

而Lasso的目標(biāo)是得到下面這個(gè)方程的最小值：

NGK與這兩種不同，NGK除了尋找高維變量的線性關(guān)系外，還加入非線性模型kernel函數(shù)，包含非顯著的隱藏變量，此模型表述為：

其中f(Xt)是未知函數(shù)，K是kernel矩陣對(duì)應(yīng)的希爾伯特空間，而α是未知常數(shù)。這樣kernel模型可以表達(dá)為一個(gè)非線性方程：

其中g(shù)是未知的高斯形態(tài)函數(shù)，Dj是第(k,l)個(gè)輸入的dklj=-(xjk-xjl)2組成的矩陣。這時(shí)選用變量ξ=(ξ0,ξ1,…, ξp)，NGK的目標(biāo)函數(shù)則是：

每次使用10組數(shù)據(jù)中的9組作為機(jī)器學(xué)習(xí)的訓(xùn)練組，用剩余的1組作為檢驗(yàn)組，通過反復(fù)選組10次，可以獲得預(yù)測(cè)值。包括最大值，最小值，Q25，Q50（中值），Q75，和平均值。

圖4：細(xì)胞系的Kernel機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)結(jié)果。

僅使用16組微流體通道中細(xì)胞的速度變量作為目標(biāo)的高維變量組，使用三種機(jī)器學(xué)習(xí)方法識(shí)別出的不同類型的細(xì)胞，TNBC乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與普通上皮細(xì)胞MCF-10A的識(shí)別率為81-84%，其中NGK和Lasso方法比Ridge方法的結(jié)果更顯著。同樣對(duì)于TNBC的HCC-1806與普通細(xì)胞對(duì)比結(jié)果為82-85%；而ER+/PR+/Her2-的乳腺癌細(xì)胞MCF-7與普通細(xì)胞對(duì)比結(jié)果為80-84%。所以基于癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的生物機(jī)械特性，機(jī)器學(xué)習(xí)方法就可以達(dá)到80%以上的識(shí)別率。

圖5：病人乳腺癌組織的Kernel機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)結(jié)果。

同樣的方法應(yīng)用于乳腺癌病人的活檢樣品上，由于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在的情況，機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)結(jié)果比細(xì)胞系較低，但仍能給活檢樣品提供轉(zhuǎn)移性和浸潤(rùn)性提供數(shù)據(jù)支持。

文章信息：Xiang Ren, Parham Ghassemi, Yasmine M.Kanaan, Tammey Naab, Robert L. Copeland, Robert L. Dewitty, Inyoung Kim,Jeannine S. Strobl, and Masoud Agah. "Kernel-basedmicrofluidic constriction assay for tumor sample identification."ACS sensors,vol. 3, no. 8 (2018):1510-1521.

這篇2018年的文章延續(xù)了作者2017年發(fā)表在ACS Sensors上的文章。