新墨西哥州立大學(xué)：時間分辨流式細(xì)胞術(shù)

“OBIS激光器支持我們工作所需的快速直接數(shù)字調(diào)制，而且添加和移除這些即插即用激光器非常容易，它們都具有相同的形式和適用性。它們提供了豐富的數(shù)據(jù)?！?-Jessica Houston，美國新墨西哥州拉斯克魯塞斯市新墨西哥州立大學(xué)化學(xué)與材料工程系教授。

挑戰(zhàn)

新墨西哥州立大學(xué)Jessica Houston教授的研究小組研究了在流式細(xì)胞術(shù)中使用時間分辨測量的獨特方法。該小組關(guān)注的一個重要領(lǐng)域是在化療藥物存在的情況下，使用熒光壽命測量法對癌癥細(xì)胞進(jìn)行代謝圖譜繪制，評估其活力。另一個關(guān)鍵應(yīng)用靶向基本細(xì)胞信號傳導(dǎo)和受體活性，使用F?rster(熒光)共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)和熒光蛋白。

Houston指出，時間分辨流式細(xì)胞術(shù)與大多數(shù)現(xiàn)有的流式細(xì)胞儀應(yīng)用程序明顯不同，后者依賴穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)來執(zhí)行計數(shù)和分選功能。商業(yè)上可買到的針對穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)優(yōu)化的流式細(xì)胞儀不適合她的研究。因此，作為第一步，她的團(tuán)隊必須建立自己的流式細(xì)胞儀。

有兩種眾所周知的測量熒光壽命的方法：在時域中使用脈沖激光或其他光源，或者在頻域中。Houston解釋說，“我們需要一臺高通量流式細(xì)胞儀來對大量細(xì)胞進(jìn)行無損計數(shù)和/或分類，例如，用于研究血液中的轉(zhuǎn)移性癌癥細(xì)胞。而使用光子計數(shù)的時域測量無法支持必要的吞吐量。因此，我們決定在頻域工作，在頻域中，既定的方法是對細(xì)胞的興奮性在激光上，并關(guān)聯(lián)調(diào)制熒光發(fā)射中觀察到的相移。”

圖1時間分辨流式細(xì)胞儀的關(guān)鍵元件

圖2組裝時間分辨流式細(xì)胞儀

解決方案

休斯頓小組希望在他們的工作中除了研究NADH和FAD等代謝物的內(nèi)源性熒光外，還能夠使用許多不同的熒光團(tuán)。因此，他們需要多種激光波長來有效地激發(fā)所有這些不同的目標(biāo)。他們還需要在光束指向和功率噪聲方面具有良好模式質(zhì)量(即低M2)以及高穩(wěn)定性輸出的激光器。

經(jīng)過仔細(xì)評估，他們決定使用Coherent的OBIS激光器。Houston指出：“我們目前有幾種波長包括375 nm、405 nm、488 nm和633 nm的OBIS激光器。這些智能激光器非常適合我們的工作。除了高質(zhì)量的輸出外，它們還支持我們工作所需的快速直接數(shù)字調(diào)制，加上添加和移除這些形狀和尺寸相同的即插即用激光器非常容易?！薄！八赋?，10瓦甚至100瓦的可用性是OBIS的另一個重要功能。這是因為她的許多實驗都是基于頻域壽命測量的，其中數(shù)字調(diào)制基本上將流動池的激光功率降低了50%

結(jié)果

休斯頓表示，她定制的流式細(xì)胞儀和越來越多的OBIS激光已被證明是一個成功的組合，并已為她的代謝譜研究和FRET工作提供了大量數(shù)據(jù)。

對于代謝譜，她引用了NADH的例子，其中測量的熒光壽命取決于該代謝物在被評估的細(xì)胞中主要處于結(jié)合狀態(tài)還是未結(jié)合狀態(tài)。這與細(xì)胞如何產(chǎn)生ATP有關(guān)，ATP是一種為大多數(shù)細(xì)胞活動提供能量的分子。正常細(xì)胞的代謝活性主要依賴線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)來產(chǎn)生ATP。但在許多類型的癌細(xì)胞中，糖酵解在ATP的產(chǎn)生中發(fā)揮著更大的作用，OXPHOS的能力降低。因此，休斯頓研究小組可以使用NADH壽命作為細(xì)胞對新治療反應(yīng)的定量指標(biāo)。

該小組還使用該系統(tǒng)快速獲取定量FRET數(shù)據(jù)。他們正在分析這些數(shù)據(jù)，以更好地了解蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)行蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，并探索酶的作用。休斯頓指出，“我們可以觀察供體熒光團(tuán)是否處于猝滅狀態(tài)。我們還可以捕捉供體發(fā)射和受體發(fā)射。同樣，這些數(shù)據(jù)可以表明癌癥治療的有效性?？偠灾?，OBIS激光器和我們的高通量細(xì)胞儀確實提供了豐富的數(shù)據(jù)?！?br />
審核編輯 黃宇