純相位空間光調(diào)制器在PSF工程中的應(yīng)用

一、引言

2014年諾貝爾化學(xué)獎揭曉，美國及德國三位科學(xué)家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner獲獎。獲獎理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”，從此人們對點擴散函數(shù)(PSF) 工程的認(rèn)識有了顯著提高。

Moerner 展示了 PSF 工程與 Meadowlark Optics SLM 的使用案例，用于熒光發(fā)射器的超分辨率成像和 3D 定位。PSF工程已被證明使顯微鏡能夠使用多種成像模式對樣本進行成像，同時以非機械方式在模式之間變化。這允許對具有弱折射率的結(jié)構(gòu)進行成像，以及對相位結(jié)構(gòu)進行定量測量。已證明的成像方式包括：螺旋相位成像、暗場成像、相位對比成像、微分干涉對比成像和擴展景深成像。

美國Meadowlark Optics 公司專注于模擬尋址純相位空間光調(diào)制器的設(shè)計、開發(fā)和制造，有40多年的歷史，該公司空間光調(diào)制器產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于自適應(yīng)光學(xué)，散射或渾濁介質(zhì)中的成像，雙光子/三光子顯微成像，光遺傳學(xué)，全息光鑷(HOT)，脈沖整形，光學(xué)加密，量子計算，光通信，湍流模擬等領(lǐng)域。其高分辨率、高刷新率、高填充因子的特點適用于PSF工程應(yīng)用中。

二、空間光調(diào)制器在PSF工程中的技術(shù)介紹

在單分子定位顯微鏡（SMLM）中，通過從相機視場中稀疏分布的發(fā)射點來估計單個分子的位置，從而克服了分辨率的衍射限制?？蓪崿F(xiàn)的分辨率受到定位精度和熒光標(biāo)簽密度的限制，在實踐中可能是幾十納米的數(shù)量級。有科研團隊已經(jīng)將這種技術(shù)擴展到三維定位。通過在光路中加入一個圓柱形透鏡或使用雙平面或多焦點成像，可以估算出分子的軸向位置。光斑的拉長（散光）或光斑大小的差異（雙平面成像）對軸向位置進行編碼。將空間光調(diào)制器（SLM）與4F中繼系統(tǒng)結(jié)合到成像光路中，可以設(shè)計更廣泛的點擴散函數(shù)（PSF），為優(yōu)化顯微鏡的定位性能提供了可能。

利用空間光調(diào)制器（SLM）對熒光顯微鏡進行校準(zhǔn)，可以建立一個遠(yuǎn)低于衍射極限的波前誤差，SIEMONS團隊就利用Meadowlark空間光調(diào)制器實現(xiàn)了高精度的波前控制。原理證明和實驗顯示，在1微米的軸向范圍內(nèi)，在x、y和λ的精度低于10納米，在z的精度低于20納米。對這篇文獻感興趣的話可以聯(lián)系我們查閱文獻原文《High precision wavefront control in point spread function engineering for single emitter localization 》

下面我們來具體看看是如何應(yīng)用的，以及應(yīng)用效果如何。

圖2. A）SLM校準(zhǔn)分支和通過光路的偏振傳輸示意圖。額外的線性偏振濾波器沒有被畫出來，因為它們與偏振分光器對齊。B）相機上的強度響應(yīng)作為λ/2-板不同方向α的SLM的相位延遲的函數(shù)。C) 光學(xué)裝置的示意圖。一個帶有SLM的中繼系統(tǒng)被添加到顯微鏡的發(fā)射路徑中（紅色），一個單獨的SLM校準(zhǔn)路徑（綠色）被納入發(fā)射中繼系統(tǒng)中。這允許在實驗之間進行SLM校準(zhǔn)。BE：擴束器，DM：分色鏡，L：鏡頭，LPF：線性偏振濾鏡，M：鏡子。OL：物鏡，PBS：偏振分光鏡，TL：管鏡。

光路如上圖2所示，包括一臺尼康Ti-E顯微鏡，帶有TIRF APO物鏡（NA = 1.49，M = 100），一個200毫米的管狀鏡頭，一個帶有SLM的中繼系統(tǒng)被建立在顯微鏡的一個出口端口。中繼系統(tǒng)包括兩個消色差透鏡，一個向列型液晶空間光調(diào)制器（LCOS）SLM（Meadowlark，XY系列，512x512像素，像素大小=15微米，設(shè)計波長=532納米）和一個偏振分光器，用于過濾未被SLM調(diào)制的X偏振光。第一個消色差透鏡在SLM上轉(zhuǎn)發(fā)光束。

第二個中繼鏡頭確保在EMCCD上對熒光物體進行奈奎斯特采樣。顯微鏡配備了一套波長為405nm、488nm、561nm和642nm的合束激光器。

這個配置增加了一個用于校準(zhǔn)SLM的第二個光路。這個空降光調(diào)制器校準(zhǔn)光路是為測量入射到SLM上的X和Y偏振光之間的延遲差而設(shè)計的，為了測量某個SLM像素的調(diào)制，需要將SLM映射到校準(zhǔn)路徑的相機上。這種映射是通過在SLM上施加一個電壓增加的棋盤圖案來獲得的。平均捕獲的圖像和沒有施加電壓時的圖像之間的差異被用作角落檢測算法（來自Matlab - Mathworks的findcheckerboard）的輸入，以找到角落點。對這些點進行仿生變換，并用于找到對應(yīng)于每個SLM像素的CMOS像素。

圖3. SLM校準(zhǔn)程序。A) 單個SLM像素的測量強度響應(yīng)作為應(yīng)用電壓的函數(shù)。每一個極值都對應(yīng)于等于π的整數(shù)倍的相位變化，并擬合一個二階多項式以提高尋找極值的精度。強度被分割成四個部分，它們被縮放為[0 1]。這個歸一化的強度（B）被轉(zhuǎn)換為相位（C），并反轉(zhuǎn)以創(chuàng)建該特定電壓段和像素的LUT（D）。E）20個隨機選擇的SLM像素的歸一化強度響應(yīng)，顯示像素間的變化。F) 測量的波前均方根誤差是校準(zhǔn)后立即使用校準(zhǔn)LUT的相位的函數(shù)，45分鐘后，以及制造商提供的LUT。G) 在不同的恒定相位下，用于成像光路的SLM部分的LUTs。暗點表示沒有3個最大值的像素。H) 測量的平均相位和預(yù)定相位之間的差異作為預(yù)定相位的函數(shù)。

圖3解釋了SLM像素的校準(zhǔn)程序。首先，以256步測量作為應(yīng)用電壓函數(shù)的強度響應(yīng)，產(chǎn)生一連串的最小值和最大值，它們對應(yīng)于π或2π的遲滯。在被照亮的SLM平面內(nèi)的所有像素似乎有三個最大值，這意味著總的相位調(diào)制為4π或1094納米。這些極值出現(xiàn)的電壓是通過對極值附近的三個點進行擬合拋物線來找到的，這增加了精度，并充分利用了SLM的16位控制。然后，強度被分為四段，用公式（11）的逆值對這些段進行縮放并轉(zhuǎn)換為相位。相位響應(yīng)被用來為每個SLM像素構(gòu)建一個單獨的查找表（LUT），以補償SLM的非均勻性。LUT參數(shù)在SLM上平滑變化，并與肉眼可見的法布里-珀羅條紋大致對應(yīng)，表明相位響應(yīng)的差異是由于液晶層厚度的變化造成的。額外的像素與像素之間的變化可能來自底層硅開關(guān)電路的像素與像素之間的變化。完整的校準(zhǔn)需要大約5分鐘（在四核3.3GHz i7處理器上的3分鐘掃描和2分鐘計算時間），但原則上可以優(yōu)化到運行更快。

實驗結(jié)果：

圖4 測量的PSF與矢量PSF模型擬合之間的PSF比較。G-I）平均測量的PSF是由大約108個光子攜帶的信號通過上采樣（3×）和覆蓋所有獲得的斑點編制而成。比例尺表示1μm。

圖4顯示PSF模型的預(yù)測結(jié)果。通過這種方式，實驗的PSF是由～108個光子的累積信號建立起來的。實驗和理論上的矢量PSF之間的一致性通常是非常好的，甚至在最大的離焦值的邊緣結(jié)構(gòu)也是非常匹配的。剩下的差異，主要是光斑的輕微變寬，是由于入射到相機上的光的非零光譜寬度，由于發(fā)射光譜的寬度和四帶分色器的帶通區(qū)域的寬度。邊緣結(jié)構(gòu)中也有一個小的不對稱性，這可能是由光學(xué)系統(tǒng)中殘留的高階球差造成的。

所有工程PSF的一個共同特點是，與簡單的二維聚焦斑點相比，它們的復(fù)雜性必須在PSF模型中得到體現(xiàn)，該模型被用于估計三維位置（可能還有發(fā)射顏色或分子方向）的參數(shù)擬合算法。簡化的PSF模型，如高斯模型、基于標(biāo)量衍射的Airy模型、Gibson-Lanni模型，或基于Hermite函數(shù)的有效模型都不能滿足這一要求。一個解決方案是使用實驗參考PSF，或用花樣擬合這樣的PSF作為模型PSF，或者使用一個或多個查找表（LUTs）來估計Z-位置。矢量PSF模型也可以用于復(fù)雜的3D和3D+λ工程PSF。眾所周知，矢量PSF模型是高NA熒光成像系統(tǒng)中圖像形成的物理正確模型。復(fù)雜的工程PSF的另一個共同特點是對擾亂設(shè)計的PSF形狀的像差的敏感性，并以這種方式對精度和準(zhǔn)確性產(chǎn)生負(fù)面影響。為了實現(xiàn)精確到Cramér-Rao下限（CRLB），即無偏估計器的最佳精度，光學(xué)系統(tǒng)的像差水平應(yīng)該被控制在衍射極限（0.072λ均方根波前像差），這個條件在實踐中往往無法滿足。因此，需要使用可變形鏡或為產(chǎn)生工程PSF而存在的SLM對像差進行校正。自適應(yīng)光學(xué)元件的控制參數(shù)可以使用基于圖像的指標(biāo)或通過測量待校正的像差來設(shè)置。后者可以通過基于引入相位多樣性的相位檢索算法來完成，通常采用通焦珠掃描的形式。這已經(jīng)在高數(shù)值孔徑顯微鏡系統(tǒng)、定位顯微鏡中實現(xiàn)，并用于提高STED激光聚焦的質(zhì)量。

三、PSF應(yīng)用對液晶空間光調(diào)制器的要求

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光利用率

對于這個應(yīng)用來說，SLM將光學(xué)損失降到最低是很重要的。PSF工程使用SLM來操縱顯微鏡發(fā)射路徑上的波前。在不增加損失的情況下，熒光成像中缺乏信號。使用具有高填充系數(shù)的SLM可以最大限度地減少衍射的損失。

Meadowlark公司能提供標(biāo)速版95.6%的空間光調(diào)制器，分辨率達1920x1200，高刷新率版像素1024x1024，填充因子97.2%和dielectric mirror coated版本（100%填充率）。鍍介電膜版本的SLM反射率可以做到100%，一級衍射效率可以做到98%。高分辨率能在滿足創(chuàng)建復(fù)雜相位函數(shù)的同時，能夠提升系統(tǒng)的光利用率。

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刷新率（最高可達1KHz）

高速度可以實現(xiàn)實時的深層組織超分辨率成像。可見光波段最高可達1K Hz刷新速度（@532nm）。

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分辨率（1920x1200）

高分辨率的SLM是創(chuàng)建三維定位所需的復(fù)雜相位函數(shù)的理想選擇，如此能夠?qū)γ總€小像元區(qū)域的光場進行自由調(diào)控。