微流控耦合高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)代謝物

代謝物是生化調(diào)控的最終產(chǎn)物，可以實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地表征細(xì)胞的生化表型。由于細(xì)胞的異質(zhì)性和某些代謝物的快速周轉(zhuǎn)，傳統(tǒng)的檢測(cè)大量細(xì)胞的方法無(wú)法準(zhǔn)確反映單個(gè)細(xì)胞的情況，因此對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)越來(lái)越有必要。

單細(xì)胞代謝組學(xué)可以直接獲得單個(gè)細(xì)胞的代謝物信息，從而深入了解單個(gè)細(xì)胞的生理行為與其化學(xué)成分之間的關(guān)系。對(duì)于分子生物學(xué)研究和實(shí)際臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)，需要在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。因此，迫切需要高通量單細(xì)胞分析方法。

基于此，中國(guó)科學(xué)院大連化物所許國(guó)旺研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用單細(xì)胞代謝組學(xué)開(kāi)發(fā)了一種新型的非對(duì)稱蛇形通道微流控芯片，一次性能分析3000多個(gè)單細(xì)胞，可運(yùn)用于哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞酵母細(xì)胞分析。相關(guān)成果以“High-throughput single cell metabolomics and cellular heterogeneity exploration by inertial microfluidics coupled with pulsed electric field-induced electrospray ionization-high resolution mass spectrometry”為題，發(fā)表于Analytica chimica acta期刊。

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為了實(shí)現(xiàn)高通量分析，需要進(jìn)行細(xì)胞分離和聚焦，以確保單個(gè)細(xì)胞逐個(gè)引入質(zhì)譜儀。目前還沒(méi)有一種方法可以在一次實(shí)驗(yàn)中分析數(shù)千個(gè)細(xì)胞，而分析大量的細(xì)胞對(duì)于獲得有生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)是非常重要的。

因此，研究人員開(kāi)發(fā)了一種新型的非對(duì)稱蛇形通道微流控芯片，結(jié)合脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)電噴霧電離-高分辨質(zhì)譜（PEF-ESI-HRMS）方法，用于近生理?xiàng)l件下的高通量單細(xì)胞分析，一次實(shí)驗(yàn)可分析3000多個(gè)單細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞中，大約有120種代謝物被注釋，并且根據(jù)單個(gè)細(xì)胞代謝譜成功區(qū)分了兩種不同的腫瘤細(xì)胞（MCF7和HepG2細(xì)胞）。

非對(duì)稱蛇形微流控芯片的設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)高通量分析，在MS分析之前加入細(xì)胞分離和聚焦系統(tǒng)是必不可少的。微流控中的慣性聚焦可以在不使用鞘液或其他外場(chǎng)的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的精確橫向平衡位置控制和細(xì)胞間距的調(diào)節(jié)。使用這種無(wú)鞘細(xì)胞聚焦方法，細(xì)胞中的代謝物不會(huì)被過(guò)度稀釋，從而可以擴(kuò)大代謝物的檢測(cè)范圍，是一種很有前途的單細(xì)胞大規(guī)模細(xì)胞儀的進(jìn)樣方法。

研究人員設(shè)計(jì)了一種具有不對(duì)稱蛇形通道的微流控芯片，它由15個(gè)重復(fù)的S形單元和一個(gè)相連的直通道組成（圖1a）。入口區(qū)域的微通道被加寬，以減少細(xì)胞表面的法向應(yīng)力和剪切應(yīng)力。模擬測(cè)試結(jié)果表明，微流控芯片對(duì)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞具有分散和聚焦作用。

圖1 非對(duì)稱蛇形微流控芯片的設(shè)計(jì)：（a）蛇形水道的幾何示意圖；（b）第8個(gè)大彎道和第9個(gè)小彎道斷面二次流分布及矢量；（c）4s后相同直徑細(xì)胞的流線。

PEF-ESI-HRMS芯片的配置和性能

PEF-ESI-HRMS芯片包含四個(gè)部分：用于輸送細(xì)胞懸浮液的注射泵、用于分散和聚焦細(xì)胞的不對(duì)稱蛇形通道微流控芯片、PEF-ESI源和Q Exactive HF質(zhì)譜儀。為了保持細(xì)胞活力和完整性，將細(xì)胞懸浮在碳酸氫銨等滲溶液中。通過(guò)注射泵將細(xì)胞懸浮液注入微流控芯片，然后通過(guò)不對(duì)稱微通道分散和聚焦細(xì)胞。當(dāng)有序的單細(xì)胞到達(dá)納米噴霧發(fā)射器的尖端，電源產(chǎn)生的高壓方波脈沖將細(xì)胞分裂。最后細(xì)胞內(nèi)容物被立即釋放并被離子化，然后通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，從而獲得單個(gè)活細(xì)胞中代謝物的信息。

為了評(píng)估PEF-ESI-HRMS芯片的性能，將兩種癌細(xì)胞系（MCF7和HepG2）的細(xì)胞懸液引入系統(tǒng)。如總離子色譜圖（TIC）所示（圖2a），當(dāng)細(xì)胞懸浮液流動(dòng)時(shí)，獲得了單個(gè)細(xì)胞的脈沖樣信號(hào)。m/z 184.0733處的峰是磷酸膽堿，這是一種主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的重要代謝物，該信號(hào)的出現(xiàn)代表細(xì)胞的破壞，因此被用作單細(xì)胞質(zhì)譜的標(biāo)記。

磷酸膽堿的EIC（圖2b）與TIC具有良好的一致性，表明脈沖電場(chǎng)誘導(dǎo)的ESI源具有實(shí)現(xiàn)細(xì)胞碎裂和代謝物電離的能力。從MCF7（圖2c）和HepG2（圖2d）兩種不同的單細(xì)胞代謝譜中，可以觀察到HepG2肝癌細(xì)胞中代謝物的總體相對(duì)豐度較高。

圖2 采用PEF-ESI-HRMS分析MCF7和HepG2細(xì)胞系組成的不同細(xì)胞懸液。

需要注意的是，高濃度細(xì)胞懸浮液中粒子間相互作用會(huì)限制聚焦程度。細(xì)胞懸液的流速和濃度是影響單細(xì)胞質(zhì)譜的兩個(gè)重要因素。研究人員研究了不同的流速以優(yōu)化分析通量并提高系統(tǒng)穩(wěn)定性。綜合考慮微流控芯片接口所能承受的壓力和最大分析通量后，選擇1μL/min為合適流速。

為了適配這種相對(duì)較高的注入流速，在納米電噴霧發(fā)射器中施加幅度為5kV Vpp和頻率為200Hz的方波電壓。另外，以1μL/min優(yōu)化細(xì)胞懸浮液的濃度，結(jié)果如圖3b所示。單位時(shí)間內(nèi)單細(xì)胞MS信號(hào)的數(shù)量隨著細(xì)胞濃度的增加而增加，并且它們之間存在線性相關(guān)性。如圖3c所示，以1μL/min的流速和濃度為8 × 10?個(gè)細(xì)胞/mL的MCF7細(xì)胞懸浮液，最大通量可達(dá)到約80個(gè)細(xì)胞/min。與之前報(bào)道的方法相比，該方法得到的數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定。

圖3 HepG2和MCF7細(xì)胞懸液流速和細(xì)胞濃度對(duì)單細(xì)胞MS分析的影響。

提取每個(gè)脈沖峰最高點(diǎn)的質(zhì)譜信息，用于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理和分析。使用基于PEF-ESI-HRMS芯片的技術(shù)，可以從單個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到900多個(gè)特征峰，從群體細(xì)胞的LC-MS分析結(jié)果獲得的精確質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜，可以鑒定出120種代謝物。對(duì)這些代謝物按照其化學(xué)特性進(jìn)行分類，包括大多數(shù)重要的功能性代謝物，如氨基酸、?；鈮A、羧酸及其衍生物或類似物（圖3d）。

為了盡可能地保持細(xì)胞處于天然狀態(tài)，使用等滲鹽溶液作為萃取溶劑，所以檢測(cè)到的代謝物主要是水溶性好的極性代謝物?？偟膩?lái)說(shuō)，基于PEF-ESI-HRMS芯片的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀不僅展示出高通量，而且對(duì)極性代謝物檢測(cè)的覆蓋率也很高。此外，測(cè)試了儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性，連續(xù)運(yùn)行約3小時(shí)，仍然可以獲得穩(wěn)定的質(zhì)譜信號(hào)，而不會(huì)堵塞微通道或納米噴霧發(fā)射器。

PEF-ESI-HRMS芯片在單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞高通量分析中的實(shí)際應(yīng)用

使用超過(guò)3000個(gè)HepG2細(xì)胞和MCF7細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞代謝檢測(cè)分析，并使用每種類型的1000個(gè)細(xì)胞的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，來(lái)證明這種高通量方法區(qū)分各種癌細(xì)胞的實(shí)用性。根據(jù)PCA圖可以很好地區(qū)分這兩種類型的細(xì)胞（圖4a）。

基于機(jī)器學(xué)習(xí)的t-SNE和UMAP算法被用于挖掘和可視化復(fù)雜的單細(xì)胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)?？梢郧宄赜^察到MCF7和HepG2細(xì)胞的分離，并揭示了兩種癌細(xì)胞顯著的代謝異質(zhì)性。云雨圖為了識(shí)別區(qū)分這兩種癌細(xì)胞的潛在生物標(biāo)志物并評(píng)估它們的性能，進(jìn)行了ROC分析。

結(jié)果表明這些代謝物可以作為區(qū)分MCF7和HepG2細(xì)胞的生物標(biāo)志物。然后研究人員使用無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)算法孤立森林來(lái)檢測(cè)同種細(xì)胞中的異常值，結(jié)果在1000個(gè)HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了32個(gè)潛在異常值（圖4c）。非異常值的HepG2細(xì)胞在PCA圖中得到了很好的聚類，進(jìn)一步證明了該技術(shù)在分析大規(guī)模單細(xì)胞樣品時(shí)良好的穩(wěn)定性。

總體而言，HepG2細(xì)胞異常細(xì)胞中的代謝物含量高于非異常細(xì)胞（圖4d）。同樣地，鑒定了1000個(gè)MCF7細(xì)胞中的61個(gè)潛在異常值，結(jié)果如圖4e所示。與能量代謝密切相關(guān)的幾種關(guān)鍵代謝物在異常MCF7細(xì)胞中的含量相對(duì)較高（圖4f）?；谝陨辖Y(jié)果，異質(zhì)性細(xì)胞的概率約為5%，表明該技術(shù)具有探索細(xì)胞代謝異質(zhì)性的潛力。

圖4 PEF-ESI-HRMS芯片在單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞高通量分析：（a）基于單個(gè)HepG2和MCF7細(xì)胞的前兩個(gè)主成分的PCA圖；（b）MCF7和HepG2單細(xì)胞中亮氨酸和肌酸相對(duì)含量的云雨圖云雨圖；（c）HepG2細(xì)胞中的異常值；（d）HepG2細(xì)胞的異常值和非異常值中γ -氨基丁酸和氨基丙酮相對(duì)含量的云雨圖；（e）MCF7細(xì)胞的異常值；（f）MCF7細(xì)胞異常值和非異常值纈氨酸和磷酸相對(duì)含量的修正云雨圖。

在單個(gè)酵母細(xì)胞代謝譜分析中的實(shí)際應(yīng)用

為了證明該技術(shù)對(duì)有細(xì)胞壁的細(xì)胞也具有破壞能力，使用釀酒酵母作為模型細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這類酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁具有彈性結(jié)構(gòu)，常規(guī)代謝組學(xué)會(huì)使用酶解法、研磨法和超聲波法破壞酵母細(xì)胞壁，但這些方法都不適合單酵母分析。有研究表明，脈沖電場(chǎng)可以破壞酵母細(xì)胞壁，因此研究人員使用方波高壓脈沖使細(xì)胞快速被電傳孔，釋放出代謝物并被電離。

從單個(gè)酵母細(xì)胞中獲得的鳥(niǎo)氨酸、肌氨酸和賴氨酸的TIC和EICs（圖5a和5b）。在正離子模式下從單個(gè)酵母細(xì)胞中檢測(cè)到40多種代謝物，說(shuō)明了該方法在具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞代謝組學(xué)中的潛在應(yīng)用。

圖5 單個(gè)酵母細(xì)胞代謝譜分析：（a）分析單個(gè)酵母細(xì)胞的裝置示意圖；（b）單個(gè)酵母細(xì)胞中獲得鳥(niǎo)氨酸、肌氨酸和賴氨酸的TIC和EICs圖。

總之，研究人員建立了一種通用的基于PEF-ESI-HRMS芯片的方法，用于在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行高通量單細(xì)胞代謝組學(xué)分析。PEF-ESI-HRMS芯片與慣性微流控裝置的新型組合在提供更高的分析通量和穩(wěn)定的電噴霧方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，并保持高分析靈敏度。

1分鐘內(nèi)可完成80個(gè)癌細(xì)胞的分析，從單個(gè)HepG2或MCF7細(xì)胞中提取900多個(gè)特征峰，初步鑒定出120個(gè)代謝物，通過(guò)這種高通量方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)這兩種癌細(xì)胞系的區(qū)分。

此外，通過(guò)孤立森林算法進(jìn)一步識(shí)別了同類細(xì)胞內(nèi)的代謝異常值，說(shuō)明該方法具有鑒別代謝異質(zhì)性細(xì)胞的潛力。該方法具有良好的分析穩(wěn)定性，可以在一次實(shí)驗(yàn)中連續(xù)分析3000多個(gè)細(xì)胞。除此之外，PEF-ESI電離源還具有破碎有細(xì)胞壁的細(xì)胞如酵母的能力，并進(jìn)行分析。

因此，該技術(shù)有望為新一代高通量質(zhì)譜流式細(xì)胞儀提供靈感，并為大規(guī)模單細(xì)胞代謝組學(xué)分析發(fā)揮加速作用，以幫助生物科學(xué)和臨床研究。

審核編輯：劉清