真菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于自然界中，尤其在食品中較為常見。當(dāng)人類和動物通過食物攝入真菌毒素時，會導(dǎo)致身體功能下降，引發(fā)各種疾病甚至死亡。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強，污染范圍最廣，且能夠阻止細(xì)胞中RNA合成，在很大程度上增加人類和動物肝硬化、壞死和癌癥的風(fēng)險，已被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機構(gòu)歸為I類致癌物。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確、高效的AFB1檢測技術(shù)，及時發(fā)現(xiàn)食品安全隱患，切實保障食品安全具有重要意義。
近期，麻省理工學(xué)院及賓夕法尼亞大學(xué)研究人員利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）分子（TPE-Z）作為熒光探針，以Cy5標(biāo)記的核酸適配體作為識別元件，以氧化石墨烯（GO）作為熒光淬滅劑構(gòu)建雙色熒光信號傳感器。當(dāng)體系中引入黃曲霉毒素（AFB1）后，傳感器的熒光信號從“關(guān)”變?yōu)椤伴_”，輸出兩個熒光信號。通過監(jiān)測TPE-Z（480 nm）和Cy5（670 nm）的熒光信號變化，可實現(xiàn)對玉米、大米和大豆等食物樣品中AFB1的快速而準(zhǔn)確的檢測。相關(guān)研究成果以“Construction of AIEgens and graphene oxide based aptasensor with two-fluorescent signals for determination of Aflatoxin B1 in food Samples”為題發(fā)表于期刊Giant。
該工作涉及兩種熒光染料，其中一種為標(biāo)記在AFB1適配體5’端的發(fā)紅光的熒光染料Cy5（670 nm），另外一種為帶有正電荷且具有水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光分子TPE-Z（480 nm）。在水溶液體系中，TPE-Z處于分散狀態(tài)，背景熒光信號較低，TPE-Z帶正電荷可通過靜電吸附作用力，聚集在DNA磷酸骨架上，發(fā)出熒光信號。
由于熒光共振作用，TPE-Z的熒光點亮Cy5熒光，輸出雙色熒光信號。此外，將氧化石墨烯（GO）引入反應(yīng)體系中，由于靜電作用力和π-π堆積作用力，復(fù)合物TPE-Z/Cy5核酸適配體吸附在GO表面，此時TPE-Z分子熒光被淬滅；當(dāng)有AFB1存在時，Cy5核酸適配體特異性識別靶標(biāo)分子AFB1，形成二級結(jié)構(gòu)，從GO表面解吸附。此時TPE-Z熒光釋放，同時點亮Cy5熒光，通過監(jiān)測TPE-Z和Cy5的熒光信號，可實現(xiàn)對目標(biāo)分子AFB1的高靈敏檢測，相對于單一信號輸出檢測傳感器，該雙色熒光信號輸出傳感器檢測特異性強且靈敏度高（圖1）。
圖1 雙色熒光信號檢測傳感器檢測黃曲霉毒素AFB1示意圖
為了驗證該傳感器檢測AFB1的性能，研究人員實施了一系列驗證實驗。如圖2所示，GO與單鏈核酸分子之間通過π-π堆積作用組裝成GO/DNA復(fù)合物，該結(jié)合作用拉近了探針上的熒光基團(tuán)與GO表面的距離，從而導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的出現(xiàn)，最終完成了GO對熒光基團(tuán)的淬滅效應(yīng)。隨著GO濃度的增大，TPE-Z和Cy5的熒光強度急劇下降，當(dāng)GO的濃度達(dá)到25 μg/mL時，大部分熒光被淬滅。
圖2 雙色熒光信號檢測傳感器對不同濃度氧化石墨烯（GO）（0~40 μg/mL）的熒光響應(yīng)曲線
當(dāng)體系中存在靶標(biāo)分子AFB1時，核酸適配體特異性識別AFB1并折疊形成二級結(jié)構(gòu)，與GO之間弱的結(jié)合能力，導(dǎo)致熒光基團(tuán)TPE-Z和Cy5遠(yuǎn)離淬滅劑表面，熒光信號恢復(fù)（圖3）。
圖3 雙色熒光信號檢測傳感器對黃曲霉毒素B1（AFB1）和不同反應(yīng)時間熒光信號響應(yīng)
如圖4所示，隨著靶標(biāo)分子AFB1量的增多，TPE-Z和Cy5的熒光強度也逐漸增強，在線性范圍為0.005~300 ng/mL時，最低檢測限可低至0.04 ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單一信號輸出檢測傳感器，證明該雙色熒光信號輸出傳感器具有較高檢測靈敏度。
圖4 雙色熒光信號檢測傳感器檢測黃曲霉毒素B1（AFB1）濃度熒光譜圖和線性曲線
食物中存在很多種真菌毒素，對檢測體系具有一定的干擾作用，核酸適配體對靶標(biāo)分子的特異性識別功能，對其它真菌毒素不具有或識別功能較弱。如圖5所示，在有靶標(biāo)分子AFB1存在時，TPE-Z和Cy5的熒光信號大幅增強，而對其它與AFB1結(jié)構(gòu)相似且在食物種普遍存在的真菌毒素如赭曲霉毒素（OTA）和玉米赤霉素烯酮（ZEN）不具有熒光信號響應(yīng)功能，說明該雙色熒光信號輸出傳感器對AFB1具有高特異性檢測功能。
圖5 雙色熒光信號輸出檢測傳感器對黃曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素（OTA）和玉米赤霉素烯酮（ZEN）的熒光信號響應(yīng)和圓二色譜圖
為了驗證該雙色熒光信號輸出檢測傳感器檢測AFB1的適用性和可靠性，研究人員將該傳感器應(yīng)用于玉米、大米和大豆等食物樣品中AFB1檢測。如表2所示，食物樣本提取液中未檢測到AFB1，而向食物樣本提取液中摻雜1.00 ng/mL和1.68 ng/mL的AFB1，得到92.3%~108.7%的回收率，與商業(yè)中廣泛使用的HPLC法檢測結(jié)果相吻合，該統(tǒng)計結(jié)果說明該雙色熒光信號輸出檢測傳感器能有效的用于食物樣品中AFB1的追蹤分析。
表2 雙色熒光信號輸出檢測傳感器檢測食物提取液中黃曲霉毒素B1（AFB1）：a）測定值均值；b）標(biāo)準(zhǔn)差；c）?未檢測出黃曲霉毒素（AFB1）
審核編輯：劉清