用于葉綠素分析的分光光度計(jì)

描述

光譜學(xué)用于確定或量化給定樣品的成分。構(gòu)成這種成分的分子和原子類型將吸收某些波長(zhǎng)的光，同時(shí)讓其他光通過。與對(duì)照相比，從給定樣品吸收的光量之間的差異可用于測(cè)量組合物在特定波長(zhǎng)下的吸光度。

吸光度值可進(jìn)一步用于色度分析以確定化學(xué)溶液的濃度。

介紹

該項(xiàng)目的目標(biāo)是確定沉水植物和藻類標(biāo)本的健康狀況；但是，它也可以用于浮現(xiàn)物種。為了確定植物或藻類的健康狀況，我們首先必須測(cè)量它們的葉綠素濃度，這是分光光度計(jì)的用武之地。

分光光度計(jì)使用主波長(zhǎng)峰值分別為 645nm 和 663nm 的發(fā)光二極管 (LED)。這些波長(zhǎng)中的每一個(gè)都代表葉綠素 a 和 b 的峰值吸收范圍。光線落在光敏電阻 (LDR) 上，隨著更多光線落在其上，電阻會(huì)降低，從而導(dǎo)致 Arduino 測(cè)量的電壓增加。

通過使用來自 LDR 的電壓變化，可以確定吸光度水平，因此也可以確定葉綠素濃度。目的是使用這些葉綠素濃度來確定植物或藻類種群是否健康。

設(shè)計(jì)

圖 1：使用 LTspice [2] 的分光光度計(jì)的電路級(jí)示意圖

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對(duì)于這個(gè)項(xiàng)目，使用了 OPEN-SMART Rich UNO R3 板，因?yàn)樗亲鳛?Biomaker 挑戰(zhàn)的一部分提供的。該板使用與 Arduino Uno 相同的引腳布局，非常適合該項(xiàng)目。

圖 2：從 Arduino 網(wǎng)站看到的 Arduino Uno 板

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電路設(shè)計(jì)

• 去抖按鈕

按鈕本身在按下時(shí)不會(huì)產(chǎn)生單個(gè)開關(guān)信號(hào)，因?yàn)榻饘龠B接器之間會(huì)發(fā)生振動(dòng)，從而導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的輸出。

為了克服這種不可預(yù)測(cè)的輸出，按鈕需要去抖動(dòng)。這可以在代碼內(nèi)或物理電路內(nèi)實(shí)現(xiàn)；該項(xiàng)目的實(shí)施選擇了后者。

為了實(shí)現(xiàn)按鈕的去抖動(dòng)，我們需要一個(gè) 27 kΩ 和 100 kΩ 電阻以及一個(gè) 1 uF 電容。如圖 1 所示，將這些組件連接到面包板上。紅色（5V）和紫色（地）線也應(yīng)連接到 Arduino。

最終產(chǎn)品應(yīng)如下所示：

圖 3：去抖動(dòng)按鈕的物理實(shí)現(xiàn)

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• LED電路配置

分光光度計(jì)分兩個(gè)階段工作，分別測(cè)量不同的波長(zhǎng)吸收。階段的順序無關(guān)緊要，只要它們是分開的即可。在本例中，我們將使用 645 nm LED 作為階段 1，將 660 nm LED 作為階段 2。

第 1 階段：將其中一個(gè)較小面包板頂行上的 2 個(gè) 645 nm LED 連同一個(gè) 200 Ω 電阻連接到具有公共接地的 LED 的較短腿上。使用較長(zhǎng)的腿將引腳 D9 和 D11 分別連接到它們自己的 LED。

第 2 階段：使用與第 1 階段相同的電阻器配置連接同一面包板底行上的 2 個(gè) 660 nm LED。對(duì)于此階段，使用較長(zhǎng)的腿將引腳 D12 和 D13 分別連接到它們自己的 LED。

圖 4：LED 電路的物理實(shí)現(xiàn)

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• LDR 電路配置

LDR 沒有極化，因此它們可以放置在任何旋轉(zhuǎn)配置中。

將 LDR 分別放在第二個(gè)較小的面包板的下半部分。將一個(gè) 12 kΩ 電阻器連接到每個(gè) LDR 的內(nèi)腿以及它們各自的輸出引腳，即 A1 和 A3。電阻器可以連接到公共地線，每個(gè) LDR 還應(yīng)連接到其外部引腳的 5 V 電壓。

圖 5：LDR 電路的物理實(shí)現(xiàn)

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繼續(xù)將電路中尚未連接的任何電線連接到 Arduino 上各自的端口，如圖 1 所示。

組合電路

現(xiàn)在分光光度計(jì)的所有獨(dú)立電路組件都已設(shè)置好，我們可以開始將它們組裝在一起。

任何有蓋的足夠大的容器都可以用來裝分光光度計(jì)（我們用的是舊鞋盒）。容器也需要不透明，因?yàn)槲覀儾幌Ｍ魏尾恍枰墓庠从绊懡Y(jié)果。

使用雙面膠帶將 LED 和 LDR 電路放在容器的相對(duì)兩側(cè)。將兩個(gè)電路調(diào)平，使其高度與放置在兩個(gè)電路之間的比色皿相同。在一張紙箱紙或任何其他柔軟但堅(jiān)固的材料上剪下兩條窄縫（我們使用的是 A4 書的精裝本）。

在 LED 和 LDR 電路之間放置并對(duì)齊狹縫（當(dāng) LED 發(fā)光時(shí)，此步驟更容易）。Arduino 和去抖動(dòng)按鈕板可以放置在容器底部或任何其他合適的方式。

現(xiàn)在也是整理項(xiàng)目的好時(shí)機(jī)，以避免電路超出圖 6 所示的電線。

圖 6：最終組裝演示

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編譯并運(yùn)行為 Arduino 提供的代碼后，我們可以從介紹中指定的如何使用分光光度計(jì)的示例開始。

*注意：我們使用圓柱形樣品瓶，因?yàn)樵嚬芎茈y找到。這種變化需要一些調(diào)整和對(duì)齊，因?yàn)槿绻∑繘]有與狹縫正確對(duì)齊，光線很容易彎曲然后廣泛散射。

額外：葉綠素測(cè)量

• 用于葉綠素測(cè)量的植物物種的樣品制備，其中使用研磨沉降法，如 [1, p. 532]：

從 Mircrosorum ptreropus（爪哇蕨）水生植物物種的葉子中提取了 300 毫克樣品。然后將該樣品在研缽和研杵內(nèi)用 5 mL 80% 丙酮和 10 mg 碳酸鈣研磨約 3 分鐘。

然后將混合物轉(zhuǎn)移到小瓶中，加入 80% 丙酮使總體積達(dá)到 25 mL。然后將該溶液在黑暗中儲(chǔ)存12小時(shí)。

圖 7：右側(cè)為研磨混合物，左側(cè)為最終 25 mL 溶液

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在 12 小時(shí)的等待期后，立即過濾小瓶的內(nèi)容物并轉(zhuǎn)移到比色皿中。另一個(gè)比色皿僅填充 80% 丙酮并用作對(duì)照。

將兩個(gè)比色皿放入分光光度計(jì)的支架中，測(cè)量光強(qiáng)度并使用附錄 A 中的公式 1 計(jì)算吸收率。然后使用公式 2 和 3 使用每個(gè)波長(zhǎng)的吸收值計(jì)算葉綠素 a/b 濃度附錄 A 中提供。

正如我們?cè)陧?xiàng)目中所經(jīng)歷的那樣，由于制造的電子元件具有很大的工作可變性，因此每個(gè)設(shè)備的結(jié)果可能會(huì)有所不同。由于這些差異，我們決定測(cè)量已知不健康植物或藻類的葉綠素水平。然后將這些測(cè)量結(jié)果與未知樣本的結(jié)果進(jìn)行比較，以確定植物或藻類的健康狀況。

項(xiàng)目擴(kuò)建

該項(xiàng)目構(gòu)成了工作分光光度計(jì)的基礎(chǔ)，具有很大的更改和/或擴(kuò)展空間。

進(jìn)一步改進(jìn)分光光度計(jì)功能的想法：

• 使用棱鏡和步進(jìn)電機(jī)以及涵蓋所有這些波長(zhǎng)范圍的光源轉(zhuǎn)換為完整的電磁光譜觀察。
• 添加輸出設(shè)備以滿足用戶的需求，例如 LCD 顯示器以顯示 Arduino 串行監(jiān)視器上顯示的輸出。
• 添加組合輸入/輸出設(shè)備以滿足用戶的需求，例如添加觸摸屏顯示器來監(jiān)控和管理設(shè)備的操作。

參考

[1] S. Su, Y. Zhou, JG Qin, W. Yao, and Z. Ma, “水生植物葉綠素提取方法的優(yōu)化” , 淡水生態(tài)學(xué)報(bào), vol. 25，沒有。4，第 531-538 頁，2010 年。

[2] M. Engelhardt，LTspice? XVII，2016 年。

附錄 A

• 讓 X = 樣品光強(qiáng)度
• 讓 Y = 控制光強(qiáng)度

吸光度 = log10( Y/X ) (1)

葉綠素提取方程從 [1, p. 533]。

• 令 A645 = 波長(zhǎng)為 645nm 的光的吸光度
• 令 A663 = 波長(zhǎng)為 663nm 的光的吸光度

葉綠素 a (μg/g) = 12.72(A663) - 2.59(A645) (2)

葉綠素 b (μg/g) = 22.9(A645) - 4.67(A663) (3)