十偏振分辨倍頻顯微鏡及其圖像處理介紹的詳細說明

　　在非線性光學顯微鏡中，二倍頻（SHG）成像通常用于觀測內源性纖維狀結構，且 SHG 的強度很大程度上取決于入射光束的偏振方向與目標分子取向軸之間的相對角度。因此，基于偏振的 SHG 成像（P－SHG），可通過分析 SHG 信號強度與入射光束的偏振態(tài)之間的函數(shù)關系，來獲得目標分子的結構信息。其現(xiàn)在已用作醫(yī)學和生物學分析的重要工具。簡單的 SHG 圖像可以通過傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光顯微鏡（TPM）獲得。大多數(shù) TPM 系統(tǒng)仍采用基于運動鏡面的單束掃描方法，其時間分辨率取決于鏡面的物理移動速度。為了實現(xiàn)更高速的成像，TPM 系統(tǒng)還可以采用多束掃描的方法（圖 1A），其中之一便是利用轉盤掃描單元。該單元由共軸的微透鏡轉盤和針孔轉盤構成，兩個轉盤上的微透鏡和針孔一一對應。激光在通過微透鏡轉盤時，波前會覆蓋多個微透鏡，不同微透鏡將波前各部分聚焦到不同的位置，并穿過對應的針孔，形成多個微光束。這些微光束打到樣品上，可同時激發(fā)多個信號。這些信號沿顯微鏡系統(tǒng)返回并再次穿過針孔，最后被兩個轉盤之間的二向色鏡反射到檢測裝置中。然而，常規(guī)使用的鎖模鈦寶石激光器作為光源能量不足，限制了激發(fā)光束的數(shù)量，導致使用轉盤掃描單元的 TPM （TPM－SD） 的有效視場 （FOV） 很小。 Ai Goto 等人想通過 TPM－SD 系統(tǒng)實現(xiàn)高速的 P－SHG 成像，并保證大的 FOV，故在 TPM－SD 系統(tǒng)中引入了峰值功率更高的基于 Yb 的激光光源。圖 1 是他們開發(fā)的 TPM－SD 系統(tǒng)示意圖。該系統(tǒng)光源為基于 Yb 的激光器，產生的飛秒脈沖中心波長為 1042 nm、平均功率 4 W、脈寬 300 fs，重復頻率 10 MHz。系統(tǒng)首先通過半波片和格蘭激光偏振器來調節(jié)激光功率，接著通過擴束器進行擴束，擴束后的光束被引入到轉盤掃描單元中，接著從掃描單元出來的多個微光束通過水浸物鏡被聚焦在樣品的多個點上。為了調整光束在物鏡處的偏振態(tài)，激發(fā)光束的光路上放置了一個半波片和一個四分之一波片。為了測量樣品上入射光束的偏振態(tài)，在物鏡后端放置了一個線性偏振膜。在這項研究中，他們使用了圓偏振光（圖 1B；橢圓度 0．95）和 4 種線偏振光束（圖 1C－F；橢圓度 0．2－0．3）。以 FOV 的水平軸為基準，將橫向偏振角設置為 0、45、 90 和 135°。物鏡收集到的熒光或 SHG 光通過針孔轉盤，被二向色鏡反射至偏振分束器。偏振分束器將信號分離為一對偏振分辨信號，它們被放大倍數(shù)為×1．2 的中繼透鏡分別聚焦在電子倍增 CCD 相機的不同方形檢測區(qū)域上，從而同時獲取一對矩形圖像。軸向掃描是通過壓電驅動器實現(xiàn)的。