中科院半導(dǎo)體所和山東大學(xué)聯(lián)合設(shè)計(jì)了一種聲表面波細(xì)胞裂解器件

【背景介紹】

細(xì)胞裂解是獲取細(xì)胞內(nèi)蛋白，細(xì)胞器以及遺傳物質(zhì)等物質(zhì)的關(guān)鍵步驟。通常，細(xì)胞裂解可通過物理方法，化學(xué)方法以及生物方法來實(shí)現(xiàn)，例如超聲裂解，酸堿裂解和酶裂解等。這些方法通常需要大量的細(xì)胞樣品或較長的裂解處理時(shí)間，這對(duì)其應(yīng)用產(chǎn)生了限制。近年來基于微流控的細(xì)胞裂解方法發(fā)展迅速，為微量細(xì)胞樣品快速高效裂解提供了平臺(tái)。雖然在微升液滴尺度上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可以顯著地降低樣本的消耗以及裂解所需要的時(shí)間，但是這些方法通常也需要外電場或者裂解酶等特定結(jié)構(gòu)或試劑來輔助裂解，其集成性和應(yīng)用性依然受限。因此生物檢測領(lǐng)域?qū)τ诰哂衅者m性的微量細(xì)胞快速裂解的方法依然有迫切需求。

近年來，基于聲表面波的微流控技術(shù)在細(xì)胞分選以及生化傳感方面大放異彩。聲表面波是一種由射頻信號(hào)在壓電基片上激發(fā)的彈性波，其波長處于微米量級(jí)，是一種理想的在微納米尺度進(jìn)行細(xì)胞操控和處理的工具。目前，基于聲表面波的微量細(xì)胞裂解方法主要是通過聲場中的剪切力裂解以及聲壓裂解來實(shí)現(xiàn)，可以在高功率下實(shí)現(xiàn)有效的細(xì)胞裂解。然而，為獲得剪切力需要構(gòu)建的聲子晶體結(jié)構(gòu)制備復(fù)雜，而聲壓破碎又有相當(dāng)大的功耗以及不穩(wěn)定性，導(dǎo)致其在進(jìn)一步集成應(yīng)用上具有較大限制。因此，如果能夠通過引入納米或者微米量級(jí)的顆粒，使其與尺寸相近的細(xì)胞進(jìn)行相互作用，由此產(chǎn)生的相互作用力就有望使細(xì)胞在較低的功率下實(shí)現(xiàn)裂解，實(shí)現(xiàn)低成本的細(xì)胞裂解，將會(huì)具有非常大的實(shí)用意義。

【成果簡介】

近日，中央民族大學(xué)耿照新教授、中科院半導(dǎo)體所陳弘達(dá)研究員和山東大學(xué)劉宏教授聯(lián)合設(shè)計(jì)了一種聲表面波細(xì)胞裂解器件，可以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞在微量液滴中的高效裂解，并對(duì)裂解原理和機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的闡釋介紹。該器件僅由壓電基片鈮酸鋰（LiNbO3）襯底及其上的一對(duì)平行叉指電極（IDTs）和一端的雙層3M膠帶組成，其中叉指電極周期為120 mm，為了減少雜波生成，在叉指電極上設(shè)計(jì)了80個(gè)聲波周期。進(jìn)行裂解時(shí)，僅需在膠帶前滴加5-20 mL包含有微粒和細(xì)胞的混合液滴，隨后通過可調(diào)節(jié)的信號(hào)源在基片上產(chǎn)生行波聲表面波，在基片上傳播的聲表面波將會(huì)耦合到含有微米顆粒和細(xì)胞的液滴中，產(chǎn)生聲流場，帶動(dòng)聲流場中的微粒和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。由于微粒和細(xì)胞具有不同的物理性質(zhì)，在曳力作用下產(chǎn)生不同的加速度，因而在聲流場中反復(fù)經(jīng)歷加速、碰撞和再加速的過程，在細(xì)胞-微粒界面處由于碰撞時(shí)巨大的動(dòng)量交換產(chǎn)生強(qiáng)大的相互作用力使得細(xì)胞膜功能喪失，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞裂解。經(jīng)過對(duì)試驗(yàn)條件的優(yōu)化和多種細(xì)胞裂解的嘗試，找到了最優(yōu)的裂解條件，實(shí)現(xiàn)了100%的細(xì)胞裂解。通過細(xì)胞膜胞內(nèi)蛋白以及細(xì)胞核的三種熒光的裂解前后熒光對(duì)比證明了細(xì)胞裂解后胞內(nèi)蛋白得到有效釋放，可用于后續(xù)生化傳感過程。針對(duì)不同種類微粒的裂解實(shí)驗(yàn)，通過掃描電鏡圖片捕捉并且通過模型還原了碰撞界面以及碰撞過程，通過流體動(dòng)力學(xué)計(jì)算估算了不同細(xì)胞和微粒在聲流場中的受力分析及加速度參數(shù)。通過與其他微量細(xì)胞裂解方法比較，說明了該方法在微量細(xì)胞裂解中具有巨大新意以及應(yīng)用價(jià)值。研究成果以題“Piezoelectric Microchip for Cell Lysis through Cell-Microparticle Collision within a Micro Droplet Driven by Surface Acoustic Wave Oscillation”作為封底（Back Cover）發(fā)表在Small上。該成果在學(xué)術(shù)流中得到眾多學(xué)者認(rèn)可，并有多位學(xué)者要求進(jìn)行合作，開展其在“干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞”、“外泌體、微泡”、“蛋白、MircoRNA”等方面的研究。

本文第一作者是山東大學(xué)博士生王世才，在耿照新教授負(fù)責(zé)的“新材料與新器件”小組開展具體工作，劉宏教授也參與全程指導(dǎo)。本項(xiàng)工作受到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“聲表面波材料與器件”以及“微納生化傳感材料與器件”的支持。

【圖文導(dǎo)讀】圖一、器件制備和表征

（a）器件制備示意圖。

（b）電極設(shè)計(jì)示意圖。

（c）電極光刻顯微鏡圖像。

（d）電極光刻顯微鏡圖像。

（e）壓電力顯微鏡（PFM）圖片。

（f）PFM下的振幅高度。

（g）PFM下的相位圖。

（h）器件實(shí)物圖。

（i）器件示意圖。

圖二、裂解原理

（a）裂解前液滴中微粒與細(xì)胞分布。

（b）活細(xì)胞受力分析。

（c）聲場中細(xì)胞與微粒受力與運(yùn)動(dòng)側(cè)視圖。

（d）死細(xì)胞受力分析。

（e）聲場中細(xì)胞與微粒受力與運(yùn)動(dòng)主視圖。

（f）裂解后細(xì)胞與微粒在液滴中的分布。

圖三、裂解影響因素的探索

（a）在直徑為4 mm的磁珠存在與否的情況下的細(xì)胞裂解效率。

（b）不同裂解功率下細(xì)胞的裂解效率。

（c）不同裂解時(shí)間下的細(xì)胞裂解效率。

（d）不同液滴體積下的細(xì)胞裂解效率。

（e）相同條件下，MDA-MB-231，MCF-7和hADSCs的裂解效率。

（f）直徑為0.5, 2, 5, 7, 15 mm的PS球和磁珠的顆粒的細(xì)胞裂解效率。

圖四、細(xì)胞裂解前后的熒光染色圖片。

（a）細(xì)胞裂解前的明場圖片。

（b）細(xì)胞裂解前的Dio細(xì)胞膜染色圖片。

（c）細(xì)胞裂解前的RFP胞內(nèi)蛋白分布圖片。

（d）細(xì)胞裂解前的Hoechst細(xì)胞核染色圖片。

（e）細(xì)胞裂解前的疊加圖片。

（f）細(xì)胞裂解后的明場圖片。

（g）細(xì)胞裂解后的Dio細(xì)胞膜染色圖片。

（h）細(xì)胞裂解后的RFP胞內(nèi)蛋白分布圖片。

（i）細(xì)胞裂解后的Hoechst細(xì)胞核染色圖片。

（j）細(xì)胞裂解后的疊加圖片。

圖五、不同種類和尺寸下裂解細(xì)胞的掃描電鏡圖像及其對(duì)應(yīng)的模型分析

（a）100 nm Au顆粒作用下的細(xì)胞裂解效率。

（b）4 mm磁珠作用下的細(xì)胞裂解效率。

（c）5 mm聚苯乙烯微流（PS）作用下的細(xì)胞裂解效率。

（d）15 mmPS作用下的細(xì)胞裂解效率。

（e）100 nm Au顆粒作用下的細(xì)胞掃描電鏡圖片。

（f）4 mm磁珠作用下的細(xì)胞掃描電鏡圖片。

（g）5 mmPS作用下的細(xì)胞掃描電鏡圖片。

（h）15 mmPS作用下的細(xì)胞掃描電鏡圖片。

（i）100 nm Au顆粒作用下的細(xì)胞裂解碰撞模型。

（j）4 mm磁珠作用下的細(xì)胞裂解碰撞模型。

（k）5 mmPS作用下的細(xì)胞裂解碰撞模型。

（l）15 mmPS作用下的細(xì)胞裂解碰撞模型。

表一、微粒參數(shù)和流體力學(xué)分析

表二、與其他微量細(xì)胞裂解方法的效率對(duì)比

【小結(jié)】

總的來說，研究人員通過向含有細(xì)胞的液滴中引入微米顆粒，利用聲場對(duì)細(xì)胞和微粒的不同加速作用實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞和微粒的碰撞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高效裂解。熒光實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過裂解，胞內(nèi)蛋白得到有效釋放，為胞內(nèi)物質(zhì)檢測提供良好的基礎(chǔ)。因此，作為一種新型微量細(xì)胞裂解方法，該器件在癌癥檢測，細(xì)胞組分分析，干細(xì)胞研究等方面具有關(guān)鍵性的意義。