微流控芯片細(xì)胞分析技術(shù)的分類及優(yōu)點(diǎn)

微流控芯片(microfluidic chip)，又稱微全分析系統(tǒng)(micro total analysis system，ì-TAS)或者芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)，是指把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)平臺。

細(xì)胞是生物體和生命活動的基本單位,細(xì)胞分析對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的研究、生命活動規(guī)律和本質(zhì)的探索、疾病的診斷與治療、藥物的篩選與設(shè)計等都具有十分重要的意義。自微流控芯片面世以來,以其微型化、集成化、自動化和便攜化等優(yōu)勢越來越多地應(yīng)用在細(xì)胞分析領(lǐng)域。

微流控芯片

微流控芯片具有分離效率高、分析速度快、分離模式多、所需樣品少、應(yīng)用范圍廣、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，充分體現(xiàn)了當(dāng)今分析設(shè)備微型化、集成化、自動化和便攜化的發(fā)展趨勢，被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物合成與篩選、農(nóng)作物育種與改良、環(huán)境監(jiān)測與控制和戰(zhàn)時對病原體檢測等領(lǐng)域。

芯片細(xì)胞分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

微流控芯片用于細(xì)胞分析，有如下的優(yōu)點(diǎn):

(1)微通道的尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，在微流控芯片上對細(xì)胞的研究可深入到單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞器水平。

(2)微尺寸通道、多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和相對封閉的環(huán)境，接近體內(nèi)的生理狀態(tài)，可實(shí)現(xiàn)無損或者微損檢測。

(3)平板式幾何構(gòu)型，更容易進(jìn)行觀察、檢測;而且傳熱、傳質(zhì)迅速，提高分析的精確度和靈敏度。

(4)可以將諸多細(xì)胞研究操作步驟集成在同一塊芯片上，有利于平行操作和連續(xù)分析。

(5)可以滿足高通量細(xì)胞分析的需要，同時獲取大量的生物學(xué)信息。

(6)芯片設(shè)計靈活多樣，可與相關(guān)分析儀器集成或聯(lián)用。

(7)節(jié)省時間、樣品和試劑，有利于降低研究成本。

芯片細(xì)胞分析技術(shù)的分類

細(xì)胞操縱

微流控芯片細(xì)胞操縱是將細(xì)胞運(yùn)送到預(yù)定的位點(diǎn)，將其固定后，進(jìn)行細(xì)胞成分、結(jié)構(gòu)和功能等分析。通常地，這還包括了對目標(biāo)細(xì)胞的分離和篩選。在微流控芯片上運(yùn)送和固定生物細(xì)胞，要求操作簡便、高效，同時能保持細(xì)胞活性。目前在微流控芯片上進(jìn)行細(xì)胞操縱的方法主要有:機(jī)械操縱法、光學(xué)操縱法、電場操縱法和磁力操縱法等。Chen等對各種細(xì)胞操縱分選技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的報道。

（1）機(jī)械操縱法

機(jī)械操縱法主要是指利用微機(jī)械加工技術(shù)，在芯片上刻蝕出各種結(jié)構(gòu)，如微篩、微阱、微溝、梳狀、堰狀、沙袋等，根據(jù)細(xì)胞尺寸的差異進(jìn)行物理分離的一種方法。它具有工作原理簡單，不需要特殊的緩沖液等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是制作微結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，而且要求目標(biāo)細(xì)胞和雜質(zhì)細(xì)胞必須有明顯的尺寸差異。Lee研究小組在微流控芯片細(xì)胞機(jī)械操縱方面做了大量的研究工作。如他們設(shè)計了一種含有U型截留結(jié)構(gòu)陣列的微流控裝置，每個U型截留單元無需表面修飾，可在30s內(nèi)截留并固定單細(xì)胞，進(jìn)而可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分析。陳興等制備了一種錯流過濾式細(xì)胞分離微流控芯片，有效地避免了芯片堵塞問題;且采用壩式分離結(jié)構(gòu)，提高了血細(xì)胞中白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離效率。孫悅等采用傳統(tǒng)光刻技術(shù)和三步刻蝕法制作了一多深度通道的微流控芯片，在分離通道中設(shè)置了圍堰，保證了單細(xì)胞在分離通道中的準(zhǔn)確定位和靜態(tài)溶膜，電泳分離后進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光檢測(LIF)，分析了人類單個腫瘤細(xì)胞中的谷胱苷肽和活性氧。

（2）光學(xué)操縱法

光學(xué)操縱的基本原理是:當(dāng)光束照射到細(xì)胞時，對細(xì)胞產(chǎn)生作用力，細(xì)胞被捕獲在光束的焦點(diǎn)附近;或者在這個力的作用下，細(xì)胞被運(yùn)送到目標(biāo)檢測分析位置。光學(xué)操縱法的優(yōu)點(diǎn)是不接觸、不損傷細(xì)胞，污染少，便于微尺寸范圍的精細(xì)操作，可達(dá)微米級的精確定位;缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴，僅適于細(xì)胞短距離操縱。光學(xué)操縱常用的是光鑷技術(shù)(optical tweezers or optical traps)，其可對細(xì)胞進(jìn)行精確的定位。Ramser等用一集成了拉曼光譜、激光光鑷的微流控芯片的裝置，對單個紅細(xì)胞進(jìn)行操控和光譜收集，從拉曼光譜特征峰位置、強(qiáng)度和線寬可實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞中的氧循環(huán)和光誘導(dǎo)作用對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相互作用的影響，也可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)藥物效應(yīng)的實(shí)時檢測。光鑷技術(shù)可用于熒光激發(fā)細(xì)胞分選(fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS)。FACS是指對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，以激光激發(fā)出的熒光信號的有無或強(qiáng)弱控制細(xì)胞的流向。Wang等設(shè)計的一種微流控裝置，可精確控制細(xì)胞位移而達(dá)到細(xì)胞分選的目的。細(xì)胞在激光束的照射下，通過綠色熒光蛋白表達(dá)發(fā)出熒光的細(xì)胞在光鑷作用下流向收集池，而非綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞因未受光鑷作用而流向廢液池。為滿足微流控芯片體積小、高通量和低成本的需要，在光學(xué)操縱中還使用了垂直腔面發(fā)射激光器(vertical cavity surface emitting lasers)及其陣列。Shao等研制了一顯微集成的VCSELs陣列截留系統(tǒng)裝置，能夠獨(dú)立控制和批量處理生物細(xì)胞，便于進(jìn)行平行操作。

細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞，模擬體內(nèi)生存環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖并維持結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)常采用瓶皿或微孔板。但是，細(xì)胞的體積微小，這些傳統(tǒng)的皿板提供的培養(yǎng)環(huán)境明顯與體內(nèi)環(huán)境相差甚遠(yuǎn)，難以真實(shí)反應(yīng)生理狀態(tài)下細(xì)胞的生物學(xué)特征性。微流控芯片具有相對封閉的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通道尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，而且芯片制作材料眾多、結(jié)構(gòu)設(shè)計靈活多樣，因而越來越多地應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)。在微流控芯片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的常用方法是灌流式培養(yǎng)(microfluidic perfusion culture)，是指將細(xì)胞懸液注入微通道或者微培養(yǎng)室，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液連續(xù)灌入培養(yǎng)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的連續(xù)更新。以下是一些應(yīng)用微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的研究報道。

單細(xì)胞內(nèi)組分分析

細(xì)胞內(nèi)組分復(fù)雜，對細(xì)胞內(nèi)成分的分析和測定、細(xì)胞成分間的相互作用的研究，有助于研究者了解體內(nèi)細(xì)胞的代謝過程、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞的功能，對疾病的治療和藥物篩選等具有重大的意義。微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)組分分析提供了一個很好的技術(shù)平臺。

（1）熒光檢測

Zare研究組設(shè)計了一種具有多層聚二甲基硅氧烷(PDMS)結(jié)構(gòu)的微流控芯片，該芯片集成了細(xì)胞操縱、試劑引入及運(yùn)輸、細(xì)胞裂解、胞內(nèi)氨基酸熒光標(biāo)記、電泳分離及LIF檢測等多種功能，實(shí)現(xiàn)了對單個T淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)6種氨基酸的檢測。最近，他們又在微流控芯片上操縱、溶胞、標(biāo)記、電泳分離和測定了單個昆蟲細(xì)胞(SF9)中的低含量蛋白質(zhì)。Culbertson等報道在微流控芯片上高通量操縱單細(xì)胞進(jìn)樣、快速電溶胞、電泳分離和熒光檢測，并將其應(yīng)用于分子細(xì)胞學(xué)的研究。

（2）電化學(xué)檢測

程介克研究組研制了一種安培檢測微流控芯片系統(tǒng)，采用碳纖維納米電極。他們用該裝置系統(tǒng)成功地測定了小鼠PC12細(xì)胞中的多巴胺。與傳統(tǒng)的微電極相比，其靈敏度和分辨率都大大提高了。Wang等采用微流控裝置結(jié)合電化學(xué)檢測研究了測定人單個血紅細(xì)胞中谷胱甘肽(GSH)的方法，細(xì)胞的進(jìn)樣、定位、溶膜以及細(xì)胞中谷胱甘肽的轉(zhuǎn)移和檢測都在配有通道端安培檢測器的雙T形芯片中完成。