FLIM系統(tǒng)是如何進(jìn)行工作的？

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)是一種用于研究和測量生物分子的熒光壽命的技術(shù)，因其可以用于無標(biāo)記成像，具有快速響應(yīng)時(shí)間，可通過高分辨率成像技術(shù)（如共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡）結(jié)合使用等特點(diǎn)，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和生命科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。那么，F(xiàn)LIM是如何實(shí)現(xiàn)如此強(qiáng)大的功能呢？

FLIM的首要任務(wù)就在于測量熒光壽命(fluorescence lifetime, FL)，待測物體被一束激光激發(fā)后，該物體吸收能量后，從基態(tài)躍遷到某一激發(fā)態(tài)上，再以輻射躍遷的形式發(fā)出熒光并回到基態(tài)。將激發(fā)光關(guān)閉后，分子的熒光強(qiáng)度也將隨時(shí)間逐漸下降。

假定一個(gè)無限窄的脈沖光（δ函數(shù)）激發(fā)n0個(gè)熒光分子到其激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)。假定兩種衰減躍遷速率分別為Γ和Knr，則激發(fā)態(tài)衰減速率可表示為：

其中n(t)表示時(shí)間ｔ時(shí)激發(fā)態(tài)分子的數(shù)目，由此可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程：

上式中衰減總速率的倒數(shù)τ＝(Γ＋Knr)-1即為熒光壽命。熒光強(qiáng)度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù)，因此可將上式改寫為:

該式中，I0即為分子受激發(fā)時(shí)的zui大光強(qiáng)。我們將該熒光強(qiáng)度下降至激發(fā)時(shí)的熒光zui大強(qiáng)度I0的1/e（約37％）所需要的時(shí)間，稱為熒光壽命。

圖1 熒光壽命曲線示意圖

對(duì)于測量熒光壽命的方式可大致分為以下兩種，頻域法與時(shí)域法。而時(shí)域法還可進(jìn)一步分為門控法、條紋相機(jī)法與tcspc法（Time-Correlated Single photon counting, 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)）。目前，應(yīng)用zui為廣泛的是TCSPC法，其基本原理是在一個(gè)極短的時(shí)間窗口內(nèi)精確測量單個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間。當(dāng)激光或其他光源激發(fā)樣品時(shí)，樣品會(huì)發(fā)射熒光光子。這些光子傳播到檢測器，其中每個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間都被記錄下來。記錄到達(dá)時(shí)間的數(shù)據(jù)可以被用來創(chuàng)建熒光壽命的時(shí)間衰減曲線，該曲線描述了熒光光子的時(shí)間分布。通過分析這些時(shí)間分布，可以獲得關(guān)于樣品的信息，如熒光壽命、發(fā)光光譜和熒光量子產(chǎn)率。其基本原理是測量光子到達(dá)探測器的時(shí)間。當(dāng)一個(gè)光子被探測到時(shí)，會(huì)觸發(fā)一個(gè)計(jì)數(shù)器，記錄光子到達(dá)的時(shí)間。通過多次測量并記錄光子到達(dá)的時(shí)間，可以生成光子到達(dá)時(shí)間的分布曲線，如圖2所示，從而獲得有關(guān)樣品的信息。

圖2TCSPC原理示意圖

TCSPC系統(tǒng)具有非常高的時(shí)間分辨率，通常在皮秒（ps）級(jí)別。這使得它能夠精確測量光子到達(dá)時(shí)間，即使在非常短的時(shí)間尺內(nèi)也能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的測量，且可以處理極低光子計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)?；诮y(tǒng)計(jì)分析的TCSPC法避免了熒光強(qiáng)度的直接測量，因而信噪比較高，探測效率近乎理想。但由于通常需要多次重復(fù)掃描來為每個(gè)像素采集足夠多的光子用于擬合熒光壽命，成像時(shí)間通常會(huì)較長。因此，如何提高成像速度與測量精度成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)。近些年來，隨著超快激光技術(shù)、高速高靈敏探測技術(shù)以及圖像處理技術(shù)等相關(guān)技術(shù)發(fā)展，為開發(fā)廉價(jià)、高性能、多功能的熒光壽命成像系統(tǒng)創(chuàng)造了條件。

圖3FLIM系統(tǒng)示意圖

上海昊量光電zui新推出了意大利FLIM LABS公司的熒光壽命成像FLIM入門套件系統(tǒng)，專門為追求單光子FLIM成像和熒光壽命光譜應(yīng)用而設(shè)計(jì)，能為您帶來高性能、高性價(jià)比的FLIM解決方案。該套件包括熒光壽命成像FLIM數(shù)據(jù)采集卡tdc、光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊、SPAD單光子探測器與熒光壽命成像FLIM軟件，并在您需要時(shí)提供恒比鑒相器模塊。

圖4 FLIM LABS的熒光壽命成像FLIM入門套件

FLIM數(shù)據(jù)采集卡TDC：

我們的緊湊型USB 供電數(shù)據(jù)采集卡專為熒光壽命成像和光譜測量而設(shè)計(jì)。其基于FPGA的可定制技術(shù)，尺寸101x139x28mm，重量輕（僅120克），總計(jì)26個(gè)I/O通道可分辨熒光壽命50ps，死區(qū)時(shí)間1.5 ns，計(jì)時(shí)精度（σ/√2）300ps，24 或 48 ps 時(shí)間 bin 分辨率，并能通過USB3.0與PC軟件直接連接，無需額外供電。

光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊：

我們的激光器模塊可用波長有405、445、488、520、635 和 850 nm，譜寬±10nm，獨(dú)立模塊，無需連接電腦。脈沖持續(xù)時(shí)間低至50ps (FWHM)，單模光纖耦合（FC/PC），150mW脈沖峰值，功率80MHz 時(shí)平均 CW 功率為 1.5mW，提供外部和內(nèi)部數(shù)字同步觸發(fā)。

SPAD單光子探測器：

我們的USB 供電光纖耦合單光子 SPAD 探測器專為時(shí)間分辨熒光壽命成像和光譜測量而設(shè)計(jì)。尺寸?。?00x60x30mm）且重量輕（235g），可通過USB 供電，光譜響應(yīng)范圍從370nm 到 900nm，7 cps 暗計(jì)數(shù)，抖動(dòng)小于200ps。

熒光壽命成像FLIM軟件：

我們的FLIM Studio軟件旨在簡化熒光壽命光譜和成像實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采集、重建和分析。該環(huán)境提供了用戶友好的界面和任何用戶都可以使用的直觀工具?？梢宰龅綄?shí)時(shí)成像和熒光衰減直方圖數(shù)據(jù)重建，實(shí)時(shí)FLIM 相量圖分析，并人工智能驅(qū)動(dòng)的相量圖分析技術(shù)，提供用于數(shù)據(jù)采集和重建的軟件API（Rust、C、C++、C#、Python、node.js、.NET），支持MATLAB、Python、HDF5、.SVG FLIM 相量和成像數(shù)據(jù)導(dǎo)出。

恒比鑒相器CFD：

我們的恒定分?jǐn)?shù)鑒別器（CFD）結(jié)構(gòu)緊湊，性能卓越。恒比鑒相器CFD允許用戶將模擬信號(hào)（例如，來自PMT的信號(hào)、脈沖激光源的同步信號(hào)等）轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。恒比鑒相器CFD模塊非常易于使用，可以與不同的顯微鏡或光譜設(shè)置相結(jié)合。單通道雙輸出模塊，區(qū)分正負(fù)輸入信號(hào)，支持上升時(shí)間<500ps，抖動(dòng)<15ps，zui大重復(fù)頻率為140MHz，zui小輸入可檢測信號(hào)為+/- 100mV，zui大輸出信號(hào)：4V@50Ohm 。

審核編輯 黃宇