光束勻化在熒光成像平場(chǎng)照明中的應(yīng)用

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡屬于光學(xué)顯微鏡家族，基于熒光的物理效應(yīng)。利用了所謂的熒光染料的顏色特性，它們被特定波長(zhǎng)的光激發(fā)，并以不同的波長(zhǎng)再次反射吸收的光。

熒光顯微鏡的應(yīng)用

熒光顯微鏡可以進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究、納米范圍內(nèi)的測(cè)量值分析以及實(shí)時(shí)可見的大多數(shù)不同文化的過程。無(wú)論是在生物化學(xué)、生物物理學(xué)還是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：快速、詳細(xì)地檢測(cè)明亮、多彩的熒光有助于熒光顯微鏡的測(cè)量過程，并為新發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。最佳測(cè)量結(jié)果和最佳分辨率需要最精確的光學(xué)器件——無(wú)論是通過光束路徑的優(yōu)化和聚焦、精確安裝的濾光片還是高質(zhì)量的鍍膜。

熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和功能原理

允許個(gè)別波長(zhǎng)通過的特殊濾光片可確保熒光顯微鏡下熒光的可視化。熒光顯微鏡的特殊濾光片包括：

勵(lì)磁濾波器

發(fā)射過濾器

二向色分束器

單獨(dú)的激發(fā)濾光片允許相應(yīng)波長(zhǎng)的光通過，這是激發(fā)待檢樣品中特定染料所必需的。二向色鏡將刺激波長(zhǎng)反射到物鏡，物鏡將光束集中到標(biāo)本上。從標(biāo)本反 射的光集中在物鏡中，在其激發(fā)態(tài)通常具有比入射光更高的波長(zhǎng)。通過二向色鏡，反射光通過發(fā)射濾光片并降低到發(fā)射波長(zhǎng)。尚未在二向色鏡處停止的刺激光的殘留物在發(fā)射濾光片處被過濾掉。理想情況下，只有發(fā)射光撞擊顯微鏡內(nèi)置的檢測(cè)器，并以相應(yīng)的顏色可見。最佳測(cè)量結(jié)果需要均勻的照明，尤其是當(dāng)需要幾微米或幾毫米的大視野時(shí)。在不均勻照明的情況下，例如，可能發(fā)生待檢查分子的不均勻激活。結(jié)果：中心的分子比入射照明光束外圍的分子發(fā)出更強(qiáng)烈的熒光。如果周邊沒有與中心等同地照亮，則當(dāng)單獨(dú)記錄的圖像網(wǎng)格稍后合并時(shí)，陰影繼續(xù)出現(xiàn)。因此，細(xì)胞和組織樣本等測(cè)量不能用于可靠的分析。這些問題可以通過使用 a|TopShape a|BeamExpander 來(lái)解決。通過使用非球面可以實(shí)現(xiàn)這些元素在系統(tǒng)中。我們的系統(tǒng)以其緊湊的設(shè)計(jì)、精度和最高的光學(xué)質(zhì)量而令人信服。使用光學(xué)組件a|TopShape 和 a|BeamExpander 可以將高斯光束轉(zhuǎn)換為均勻的平頂輪廓，從而在整個(gè)視野中實(shí)現(xiàn)均勻照明。所產(chǎn)生的平場(chǎng)照明具有高空間相干性、無(wú)與倫比的光學(xué)性能和 > 95% 的高均勻性。分子的均勻激發(fā)和最小的圖像重疊 (5%) 可以保證讓您完全滿意。

下圖顯示了熒光顯微鏡的工作原理和一般結(jié)構(gòu)。

熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡應(yīng)用

基于激光的熒光顯微鏡內(nèi)的定量分析可能會(huì)因高斯光束輪廓產(chǎn)生的不均勻 照明而變得復(fù)雜。光源和照明光學(xué)等因素會(huì)影響均勻性。當(dāng)要檢查大視野 (FOV)時(shí)，這些功能尤其具有挑戰(zhàn)性。測(cè)量圖像由圖像網(wǎng)格在熒光顯微鏡中生成。以邊緣重疊的方式獲取單個(gè)圖像，并且可以在后處理中組合它們。如果照明不均勻，最終圖像的每個(gè)單獨(dú)圖像周圍都會(huì)有變暗的邊緣 - 細(xì)胞和組織樣本的測(cè)量變得不可靠。光照不均勻的另一個(gè)缺點(diǎn)：分子激活不均勻。那些靠近光束中心的熒光比邊緣的熒光更多。位于奧蘭多的中佛羅里達(dá)大學(xué)光學(xué)與光子學(xué)院的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)通過將aphericon 的光束整形器 a|TopShape 和 a|BeamExpander 集成到顯微鏡裝置中，從而克服了這些問題。平場(chǎng)照明 (FFI) 設(shè)置將高斯光束塑造成統(tǒng)一的平頂輪廓。a|TopShape 對(duì)入射激光束大小的變化具有極高的容忍度 (± 10 %)，并且以消色差方式運(yùn)行。非常好的光學(xué)性能（均勻性 > 95%）可實(shí)現(xiàn)均勻照明，從而激活分子。此外，F(xiàn)FI 設(shè)置可實(shí)現(xiàn)無(wú)邊界拼接成像，圖像重疊最小 (5%)。

定量熒光成像的平場(chǎng)照明

項(xiàng)目介紹：

高斯輪廓的不均勻光照使得基于激光的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡的定量分析具有很高的挑戰(zhàn)性。許多因素，包括光源和照明光學(xué)有助于均勻性。當(dāng)需要幾百微米或毫米尺度的大視場(chǎng)時(shí)，這些特性尤其困難。獲得一個(gè)圖像網(wǎng)格，使邊界重疊，并在后處理中將圖像拼接在一起。如果光照不均勻，最終拼接的圖像在每個(gè)單獨(dú)的圖像周圍都有暗淡的邊界。因此，細(xì)胞和組織樣本的測(cè)量是不可靠的。非均勻光照的另一個(gè)缺點(diǎn)是分子的不均勻激活。那些最靠近光束中心的人比那些靠近邊緣的人熒光更強(qiáng)烈。

項(xiàng)目實(shí)施：

來(lái)自美國(guó)佛羅里達(dá)州奧蘭多市中佛羅里達(dá)大學(xué)光學(xué)與光子學(xué)學(xué)院的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)，在他們的顯微鏡設(shè)置中使用非球面 TopShape 和 BeamExpander 時(shí)，可以克服這些問題(b)，這兩個(gè)都是由非球面組成的非常緊湊和高精度的折光光學(xué)組件。因此，他們能夠呈現(xiàn)平場(chǎng)照明(FFI)，其中高斯光束被塑造成一個(gè)均勻的平頂輪廓(a)。光束整形裝置非常容忍入射激光束的大小變化，接受±10%，同時(shí)也是消色差的(e)。FFI 的工作距離(f)長(zhǎng)，空間相干性高，可以在多色單分子成像中實(shí)現(xiàn)均勻的 epi1 和 TIRF2 照明。所使用的光學(xué)器件具有無(wú)與倫比的光學(xué)性能，均勻性> 95%，允許均勻的照明(c & d)，從而均勻地激活分子。此外，F(xiàn)FI 實(shí)現(xiàn)了最小圖像重疊(5%)的無(wú)界縫合成像。

說明: 1,外延照明模式是指從樣品的一側(cè)進(jìn)行照明和檢測(cè);