合成生物是什么-微流控芯片技術(shù)在合成生物學的應(yīng)用前景

1.“合成生物”是什么？

合成生物其實就是一種“造物”的技術(shù)。它融合了生物學、化學和工程學等多種技術(shù)，以可再生生物質(zhì)為原料，以生物體作為生產(chǎn)介質(zhì)，旨在利用廉價原料，以菌群、細胞和酶為制造工廠，規(guī)?；l(fā)酵獲得目標產(chǎn)品，具有清潔、高效和可再生等特點。

以透明質(zhì)酸（玻尿酸）為例。最初，透明質(zhì)酸取自牛的眼睛，價格非常昂貴。但通過生物合成技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的化學技術(shù)，既安全環(huán)保，成本又低，真正實現(xiàn)了科技改變生活。合成生物學，蘊含著“一切皆可合成”的潛能，隱藏著解鎖新質(zhì)生產(chǎn)力的密碼，也是目前從海外到國內(nèi)最火的未來產(chǎn)業(yè)新賽道之一。如江南大學團隊利用合成生物學技術(shù)，借助微生物發(fā)酵生產(chǎn)普通分子量的透明質(zhì)酸，把成本降到每公斤幾百元，實現(xiàn)了透明質(zhì)酸大產(chǎn)量推廣應(yīng)用。團隊通過人工合成方法，對現(xiàn)有的、天然存在的生物系統(tǒng)進行重新設(shè)計和改造，甚至創(chuàng)造出自然界不存在的“生物結(jié)構(gòu)”，大大提高了產(chǎn)量。

2.合成生物學表型測試生物反應(yīng)器有哪些？

合成生物學經(jīng)過多年的發(fā)展，形成了典型的細胞工廠創(chuàng)制“設(shè)計-構(gòu)建-測試-學習”（design-build-testlearn， DBTL） 循環(huán)，成為支撐面向加速生物制造發(fā)展的智慧生物育種的重要方法。其中，測試環(huán)節(jié)是對前期所設(shè)計與構(gòu)建的生物體系進行表型測試，以提供大量數(shù)據(jù)用于后續(xù)的學習和迭代升級。測試階段的通量主要依賴于細胞自身或其培養(yǎng)測試所使用的生物反應(yīng)器及其裝備，是整個DBTL流程的限速步驟。本文系統(tǒng)綜述了合成生物學表型測試所開發(fā)的面向不同通量的生物反應(yīng)器及裝備，從單細胞檢測和篩選及不同尺度生物反應(yīng)器包括皮納升級生物反應(yīng)器、微升級生物反應(yīng)器、毫升級生物反應(yīng)器和升級生物反應(yīng)器等。

在DBTL循環(huán)的表型測試環(huán)節(jié)中，針對不同應(yīng)用目標和不同通量需求的測試，生物反應(yīng)器成為主要的表型研究工具，比如單細胞檢測篩選技術(shù)、基于多孔板的高通量篩選技術(shù)以及基于微流控的高通量篩選技術(shù)。

1）單細胞分選法

單細胞篩選是指根據(jù)細胞自身的特征，如細胞的形狀、密度、大小、光信號、圖像特征等進行篩選。單細胞懸滴法則是根據(jù)液滴重力或微泵將包含單個細胞的液滴分配到目標基板（如微孔板）上，而非目標液滴則被轉(zhuǎn)移至廢液收集瓶中，分選過程溫和，但速度受限。此外，近年來有許多研究在微流控芯片上設(shè)計了許多微結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)細胞或粒子的主動分選，包括微井結(jié)構(gòu)陣列單細胞捕獲、確定性橫向位移 （deterministic lateral displacement， DLD）和慣性流系統(tǒng)（inertial microfluidic），可基于單個細胞的直徑大小和彈性對大量細胞進行快速高通量分選，且無需對細胞進行標記檢測即可實現(xiàn)目標細胞分離。

圖1單細胞檢測與分選裝置工作原理圖

2）皮納升級微型生物反應(yīng)器

皮納升級生物反應(yīng)器體積范圍 1 pL～100 nL，主要包括兩種類型：一種是采用微加工技術(shù)在基板上制作微孔陣列，微孔直徑常小于500 μm，細胞裝入微孔中進行培養(yǎng)和檢測，基于

微孔的單細胞篩選的通量約為102～103個；另一種是基于微液滴的生物反應(yīng)器，它是由液滴微流控技術(shù)產(chǎn)生的，將細胞封裝在液滴中進行培養(yǎng)和檢測，液滴直徑常小于 200 μm，基于微液滴的單細胞篩選技術(shù)的通量為105～108個。這些皮納升規(guī)模的生物反應(yīng)器相對于大型生物反應(yīng)器可以有效提高細胞生長的初始濃度，為單細胞提供非競爭性的生長空間 ，更有利于細 胞的生長和代謝。

液滴微流控是指通過油相和水相在微流控芯片中進行相互剪切，形成大規(guī)模的均勻液滴群，這些液滴直徑常小于 300 μm，在微生物學高通量單細胞培養(yǎng)和分析方面已顯示出其獨特優(yōu)勢。微液滴具有通量高、體積小、易操作、傳質(zhì)傳熱迅速等特點，已日益成為單細胞分析的重要工具，其應(yīng)用包括聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、細胞培養(yǎng)、分選、分離、克隆形成、細胞裂解、基因和蛋白質(zhì)表達、抗體分泌以及細胞毒性分析研究。在微生物學領(lǐng)域，液滴通常是指油包水（Water-in-Oil， W/O）結(jié)構(gòu)的微液滴，可以很容易地通過主動和被動的液滴生成技術(shù)制備。單細胞培養(yǎng)的液滴大小從皮升到納升不等，由于細胞在生成液滴過程中是隨機分配到液滴內(nèi)的，被包裹在液滴中的細胞數(shù)量及其分布概率服從泊松分布統(tǒng)計學規(guī)律，這與有限稀釋方法類似。為了提高單細胞包封率，研究人員利用慣性流體技術(shù)或介電泳技術(shù)對芯片上液滴生成單元上游的細胞進行排序，并控制其逐一進入液滴，使得單細胞包封率可提高至 80% 以上。液滴形成后，可將液滴群儲存在小容器中，如離心管、微管或其他自制容器中，然后放置在合適的溫度、濕度和氣體環(huán)境中進行孵育，微生物可在液滴中進行增殖和代謝。考慮到不同微生物種類需要不同的氧氣濃度，研究人員采用高透氣性微管路來儲存液滴，氧氣和二氧化碳可以通過管壁不斷滲透到油相中，或者對油相進行反復充氧，使其給液滴供氧。

液滴的檢測與流式細胞術(shù)類似，其檢測信號包括熒光、拉曼、圖像、光散射、阻抗、核磁、電化學、質(zhì)譜和光吸收度等。對于液滴分選，與單細胞分選方式類似，仍然可以利用電場、磁場、光場、聲場、重力場、流體動力場所產(chǎn)生的力來驅(qū)動液滴到收集或廢液通道。通過上述檢測方式和分選方式的組合集成，可以實現(xiàn)高通量、高效率的微生物檢測與篩選。在皮納升微液滴反應(yīng)器中，較為廣泛使用的裝置是熒光激活液滴分選系統(tǒng)（fluorescence activated droplet sorting，F(xiàn)ADS）。其是將液滴熒光檢測和介電泳分選方式進行集成設(shè)計，檢測到液滴熒光信號后，如果是感興趣的目標液滴，則在微流控芯片下游用介電泳所產(chǎn)生

的驅(qū)動力推動至收集通道中，完成液滴的檢測分選，該技術(shù)平臺在微生物高通量篩選和酶進化領(lǐng)域已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用，有較多的相關(guān)文獻綜述報道。

圖2基于皮納升微液滴的單細胞表型測試與篩選

3.微流控技術(shù)在合成生物學的應(yīng)用前景展望

液滴微流控技術(shù)具有操作容易、通量高、液滴培養(yǎng)數(shù)字化和易自動化等特點，是適于合成生物學高通量表型測試的頗具廣泛應(yīng)用前景的方法。商業(yè)化的裝備系統(tǒng)體積小、運行成本低、使用和維護方便，越來越受到廣大科研人員和工程技術(shù)人員的關(guān)注，成為合成生物學發(fā)展的智慧平臺。目前，液滴微流控技術(shù)仍處于產(chǎn)業(yè)化上升期，雖然已有部分技術(shù)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化推廣，但如何進一步實現(xiàn)微液滴的高度穩(wěn)定、提升液滴通量的精準可控性、實現(xiàn)微液滴裝備的創(chuàng)新定制化以及液滴操作的標準化和自動化等方面仍然存在大量的基礎(chǔ)科學和工程科學問題需要深入研究。另外，需要發(fā)展更多適用于不同尺度液滴體系的表型測試傳感器，顯著提升表型表征能力，構(gòu)建更多維度的基因型-表型模型，為液滴微流控技術(shù)在DBTL循環(huán)中的應(yīng)用提供更強大的使能工具，最終實現(xiàn)開發(fā)國產(chǎn)替代高通量自動化合成生物設(shè)施平臺，突破我國生物技術(shù)裝備研發(fā)能力弱、自主創(chuàng)新設(shè)備欠缺等“卡脖子”問題，加速我國合成生物技術(shù)原始創(chuàng)新步伐，支撐綠色生物經(jīng)濟的高質(zhì)量發(fā)展。

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審核編輯 黃宇