單光子雪崩探測(cè)器SPAD助力激光掃描顯微鏡發(fā)展

據(jù)麥姆斯咨詢介紹，單光子雪崩探測(cè)器（SPAD）是指工作電壓高于擊穿電壓的APD，也稱為蓋革模式APD，通過配套淬滅電路和讀出電路對(duì)雪崩倍增過程進(jìn)行淬滅和恢復(fù)控制從而實(shí)現(xiàn)單光子探測(cè)。由于快速、緊湊的SPAD陣列探測(cè)器的引入，激光掃描顯微鏡領(lǐng)域正在經(jīng)歷快速發(fā)展。

SPAD探測(cè)器因其卓越的可靠性、穩(wěn)健性、易于使用和高探測(cè)效率而在顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域中獲得了青睞。異步讀出SPAD陣列探測(cè)器經(jīng)過優(yōu)化，可以顯著增強(qiáng)熒光激光掃描顯微鏡（LSM）的能力。這些專用探測(cè)器提供獨(dú)特的單光子時(shí)空信息，為溫和、定量的超分辨率成像開辟了新的可能性。

SPAD陣列需要搭配讀出電路（ROIC）使用，以實(shí)現(xiàn)雪崩信號(hào)的提取和處理，同時(shí)根據(jù)應(yīng)用需求來選用光子計(jì)數(shù)、光子計(jì)時(shí)等功能電路。將SPAD和電子器件集成在同一顆芯片上使得SPAD陣列探測(cè)器能夠加速發(fā)展。人們提出了各種設(shè)計(jì)策略來滿足特定應(yīng)用的要求。

512 x 512像素SPAD陣列探測(cè)器

初始階段涉及一個(gè)簡(jiǎn)單的SPAD像素陣列，每個(gè)像素都包含SPAD及其前端電路。后續(xù)階段涉及將處理電路集成到像素中以執(zhí)行特定功能，從而促進(jìn)每個(gè)SPAD像素的并行和獨(dú)立工作。在每個(gè)像素內(nèi)合并多個(gè)SPAD及其前端電路也可以抵消固有SPAD死區(qū)時(shí)間的影響并增強(qiáng)光子數(shù)分辨率。

熒光成像是材料分析的有效工具，特別是在生物應(yīng)用中，其中許多生物分子在照射時(shí)會(huì)顯示出自發(fā)熒光。與傳統(tǒng)的熒光成像相比，熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）采用時(shí)間分辨檢測(cè)系統(tǒng)來捕獲特征熒光壽命，而不是僅僅關(guān)注發(fā)射光的強(qiáng)度或光譜。

在掃描顯微鏡領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)必要時(shí)間分辨率的最穩(wěn)健和最有效的方法之一是使用SPAD。

在Optics Express期刊上發(fā)表的“Handheld wide-field fluorescence lifetime imaging system based on a distally mounted SPAD array”論文中，研究人員展示了一種手持式熒光壽命成像顯微鏡系統(tǒng)，采用遠(yuǎn)端安裝的“Endocam”SPAD陣列探測(cè)器，占用面積不到2平方毫米，分辨率為128 × 120像素，通過長(zhǎng)度超過1米的有線接口運(yùn)行。對(duì)于基準(zhǔn)測(cè)量，研究人員通過市售的Horiba FLIMera時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）相機(jī)來獲取準(zhǔn)確的熒光壽命信息。

手持式熒光壽命成像顯微鏡模塊及系統(tǒng)

研究人員展示了使用手持式熒光壽命成像顯微鏡系統(tǒng)拍攝的綿羊腎臟的清晰圖像。該圖像聚焦于羊腎樣本中不同組織成分區(qū)域。在熒光強(qiáng)度圖像中，沒有跡象表明該區(qū)域的組織在成分上與器官的其它部分不同。在FLIM圖像中，則表現(xiàn)出顯著的對(duì)比度，熒光壽命范圍從大約1.2 ns到大約2 ns。熒光強(qiáng)度水平非常相似的區(qū)域在熒光壽命上表現(xiàn)出明顯的差異。

“Endocam”SPAD陣列探測(cè)器能夠以超過1 Hz的頻率提供FLIM圖像，同時(shí)在距控制板約1米的距離處工作，這是一項(xiàng)重大的成就，標(biāo)志著SPAD陣列探測(cè)器首次以這種方式運(yùn)行，證實(shí)了便攜式成像系統(tǒng)可以有效地用于生物工程和其它領(lǐng)域。

根據(jù)Optics Express期刊上發(fā)表的“Challenges and prospects for multi-chip microlens imprints on front-side illuminated SPAD imagers”論文顯示，大多數(shù)前照式（FSI）SPAD陣列探測(cè)器仍然表現(xiàn)出相對(duì)較低的填充因子——通常低于50%。這種限制導(dǎo)致光子探測(cè)效率（PDE）受到影響。

在光子有限的情況下，特別是在生物光子學(xué)中，這可能會(huì)帶來挑戰(zhàn)。一些研究采用了獨(dú)特的光學(xué)系統(tǒng)，其中SPAD探測(cè)器充當(dāng)特殊類型的共聚焦針孔，使光線能夠直接聚焦在感光區(qū)域上。然而，此類設(shè)置是例外而不是常態(tài)，并且通常涉及開發(fā)和維護(hù)具有挑戰(zhàn)性的設(shè)計(jì)。

熒光壽命成像（FLI）是一種基于從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的衰變時(shí)間來表征分子的成像技術(shù)。時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）由于其在時(shí)間分辨率、動(dòng)態(tài)范圍和魯棒性方面優(yōu)于其它技術(shù)，在熒光壽命成像系統(tǒng)中越來越受歡迎。在過去的十年里，SPAD陣列探測(cè)器已經(jīng)成功地應(yīng)用于TCSPC系統(tǒng)中。然而，當(dāng)前的熒光壽命成像系統(tǒng)在處理速度和精度方面仍具有局限性。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為快速提取熒光壽命提供了一種新的途徑。在Scientific Reports期刊上發(fā)表的“Coupling a recurrent neural network to SPAD TCSPC systems for real-time fluorescence lifetime imaging”論文中，科研人員將遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RNN）集成到SPAD-TCSPC系統(tǒng)中，用于實(shí)時(shí)熒光壽命成像。

與依賴直方圖作為輸入的傳統(tǒng)深度學(xué)習(xí)方法不同，上述開創(chuàng)性研究?jī)H在數(shù)據(jù)采集后即可用，RNN消除了直方圖，并以事件驅(qū)動(dòng)的方式處理原始時(shí)間戳。這種方法有助于對(duì)每個(gè)入射光子的壽命估計(jì)進(jìn)行增量和連續(xù)更新，從而實(shí)現(xiàn)熒光壽命的實(shí)時(shí)或即時(shí)采集后讀數(shù)。這種創(chuàng)新的方法消除了存儲(chǔ)或傳輸時(shí)間戳數(shù)據(jù)或直方圖的需要，顯著減輕了硬件內(nèi)存和數(shù)據(jù)傳輸要求的負(fù)擔(dān)。

熒光共聚焦激光掃描顯微鏡是生命科學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的工具之一。SPAD陣列探測(cè)器的出現(xiàn)預(yù)計(jì)將進(jìn)一步推動(dòng)激光掃描顯微鏡的日益普及。與傳統(tǒng)的激光掃描顯微鏡單點(diǎn)探測(cè)器相比，SPAD陣列探測(cè)器保留了入射熒光光子的空間分布。與科學(xué)相機(jī)不同，每個(gè)陣列像素都作為一個(gè)完全獨(dú)立的SPAD運(yùn)行，確保了高的時(shí)間精度。將現(xiàn)代數(shù)據(jù)采集（DAQ）系統(tǒng)與SPAD陣列探測(cè)器集成，可以實(shí)現(xiàn)高效、快速的光子分辨發(fā)射測(cè)量。

近期在Advanced Photonics期刊上發(fā)表的“Compact and effective photon-resolved image scanning microscope”論文中，研究人員成功地將一種新的基于數(shù)字頻域（DFD）的DAQ和控制系統(tǒng)集成到單光子激光掃描顯微鏡（SP-LSM）中，并結(jié)合了商用的SPAD陣列探測(cè)器。該技術(shù)利用超分辨率顯微鏡（FLISM）實(shí)現(xiàn)了熒光壽命成像。

研究人員使用自適應(yīng)像素重新分配（APR）從原始數(shù)據(jù)中重建超分辨率圖像。與傳統(tǒng)的共聚焦激光掃描顯微鏡相比，超分辨率顯微鏡顯示出優(yōu)越的性能，在捕獲的圖像中顯示出更好的分辨率。

上述論文中的研究表明，激光掃描顯微鏡的未來與SPAD陣列探測(cè)器之間有著密切的聯(lián)系。將SPAD陣列探測(cè)器與定制采集系統(tǒng)集成，簡(jiǎn)化了對(duì)光子分辨成像光譜顯微鏡的數(shù)據(jù)訪問和使用。

審核編輯：劉清