微流控器官芯片中生物分子的無試劑共價(jià)固定研究

微流控系統(tǒng)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室芯片和器官芯片應(yīng)用中的重要組成部分，其通常使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片和玻璃基片制造。但這些材料缺乏生物醫(yī)學(xué)場景應(yīng)用所需的生物活性。為克服這個(gè)問題，研究人員通常使用氧（O?）等離子體對材料進(jìn)行處理或使用化學(xué)試劑（如氨基硅烷）來固定生物分子。然而，O?等離子體處理不穩(wěn)定，無法共價(jià)固定生物分子，而濕化學(xué)方法則具有毒性、耗時(shí)和昂貴的缺點(diǎn)。

近期，來自澳大利亞悉尼大學(xué)（The University of Sydney）的Anna Waterhouse和Marcela Bilek團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型微流控平臺，該平臺結(jié)合了兩種等離子體表面處理方法：等離子體活化涂層（PAC）和大氣壓等離子體射流（APPJ），從而實(shí)現(xiàn)了無試劑的共價(jià)固定生物分子。這種混合微流控平臺的鍵合強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)的O?等離子體裝置相當(dāng)，但在動(dòng)脈芯片模型中大大提高了內(nèi)皮細(xì)胞的生長。該平臺還適用于冠狀動(dòng)脈剪切等高剪切應(yīng)用。通過在微流控系統(tǒng)中提供無試劑的共價(jià)固定生物分子，這項(xiàng)技術(shù)有潛力從根本上改善器官芯片、實(shí)驗(yàn)室芯片系統(tǒng)以及即時(shí)診斷傳感器的開發(fā)。相關(guān)工作以“Reagent-Free Covalent Immobilization of Biomolecules in a Microfluidic Organ-On-A-Chip”為題發(fā)表在國際頂級期刊Advanced Functional Materials上。

PAC和APPJ在PDMS和玻璃表面誘導(dǎo)官能團(tuán)并產(chǎn)生自由基

本研究探究了利用三種不同的等離子體處理方法來處理微流控基底，它們分別是O?等離子體、PAC和APPJ（圖1A）。研究人員使用XPS和EPR進(jìn)行表面表征，以評估不同處理后的表面化學(xué)性質(zhì)。XPS分析顯示，在所有處理中，都存在一個(gè)強(qiáng)烈的氧峰，這是因?yàn)樵谔幚砗蟊┞对诳諝庵袝r(shí)，自由基和反應(yīng)性基團(tuán)容易與大氣中的氧發(fā)生氧化反應(yīng)，這個(gè)過程被稱為自氧化。與未處理樣品（UT）相比，PAC處理引入了氮和碳，這從XPS分析中N1s和C1s峰的增強(qiáng)可以明顯看出，而且不受基底的影響（圖1B、C）。為更詳細(xì)地了解基底上的碳物種和所研究的處理方法，對C1s峰進(jìn)行了解卷積，得到了4個(gè)不同的結(jié)合能（284.2、286、287.5和289 eV），分別與C-C、C-O（或C-N）、C=O（或C=N）和O-C=O鍵相關(guān)聯(lián)（圖1D）。從定性角度上看，PDMS和玻璃上的C1s峰相似。與這些基底上的O?等離子體不同，PAC處理PDMS和APPJ處理玻璃在各自的基底上引入了多樣的功能基團(tuán)，包括酮基（C=O）和羧基（O-C=O）（圖1D）。

圖1 PAC和APPJ可誘導(dǎo)形成官能團(tuán)和自由基

為進(jìn)一步表征這些表面及其老化特性，本研究評估了它們的潤濕性。樣品在室溫下儲存于環(huán)境條件中。未處理的PDMS具有109°±2的水接觸角，經(jīng)過O?等離子體、PAC和APPJ處理后，分別降至5°±2°、28.0°±1.2°和4°±2°（圖2A）。經(jīng)過O?等離子體或APPJ處理的PDMS在4天內(nèi)恢復(fù)了其原始潤濕性。未處理的玻璃具有62.37°±0.04°的水接觸角，經(jīng)過O?等離子體、PAC和APPJ處理后，分別降至6°±2°、26°±2°和5°±3°（圖2B）。在14天內(nèi)，這些處理方法都沒有恢復(fù)到玻璃的原始潤濕性。疏水恢復(fù)受到空氣暴露和較高溫度的影響。因此，可以優(yōu)化適當(dāng)?shù)臒o氧儲存條件和較低的溫度，以保持表面特性更長時(shí)間。

圖2 PDMS上的PAC潤濕性恢復(fù)較慢

PAC和APPJ可將纖連蛋白共價(jià)固定在PDMS和玻璃上

為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與表面的共價(jià)固定化，以及控制定向和高表面覆蓋度，本研究探究了等離子體處理表面共價(jià)固定關(guān)鍵細(xì)胞外基質(zhì)蛋白纖維連接蛋白的能力（圖3A）。在PDMS和玻璃上的結(jié)果相似，在未處理和等離子體處理的基底上存在相當(dāng)數(shù)量的物理吸附的纖維連接蛋白（圖3B、C）。為具體量化共價(jià)固定，樣品經(jīng)過了SDS洗滌，這是一種已經(jīng)被廣泛接受的去除非共價(jià)結(jié)合生物分子的方法。在用SDS洗滌樣品后，在未處理樣品上觀察到極少量的纖維連接蛋白，表明幾乎沒有或沒有共價(jià)固定。值得注意的是，經(jīng)過O?等離子體處理的基底也未能在PDMS和玻璃上共價(jià)固定纖維連接蛋白，在SDS處理后顯示出較低的蛋白質(zhì)水平（圖3B、C）。有趣的是，經(jīng)過APPJ和PAC處理的基底含有顯著更多的共價(jià)結(jié)合的纖維連接蛋白，在SDS洗滌后仍然保留（P < 0.05），與PDMS和玻璃上的O?等離子體和未處理樣品相比（圖3B、C）。這些數(shù)據(jù)突出了APPJ和PAC在微流控技術(shù)中共價(jià)固定生物分子的潛力。

圖3 PAC和APPJ可將纖維連接蛋白共價(jià)固定在PDMS和玻璃上

PAC和APPJ處理可促進(jìn)HCAEC在玻璃基底上的附著

在確定了PAC和APPJ共價(jià)固定纖維連接蛋白的能力后，本研究探究了人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）在玻璃和PDMS上的附著和增殖情況，以評估它們在器官芯片應(yīng)用中的潛力（圖4A）。在未處理的玻璃和PDMS上觀察到極少的細(xì)胞附著，而組織培養(yǎng)（TC）塑料強(qiáng)烈促進(jìn)了細(xì)胞附著。有趣的是，所有經(jīng)過等離子體處理的PDMS樣品的細(xì)胞附著情況相似（圖4B）。類似地，與未處理的玻璃相比，O?等離子體處理并未促進(jìn)細(xì)胞附著，但在形態(tài)上，O?等離子體處理表面上的HCAEC呈現(xiàn)出較少的圓形，表明更好地附著于底物上（圖4C）。然而，與未處理的玻璃相比，PAC和APPJ處理顯著提高了細(xì)胞在玻璃上的附著（P < 0.01），并且相對于O?等離子體處理的玻璃也有顯著改善（P < 0.05）（圖4B）。

圖4 PAC和APPJ處理可促進(jìn)HCAEC在玻璃表面的附著

PAC促進(jìn)HCAEC在PDMS和玻璃基底上增殖，APPJ促進(jìn)HCAEC在玻璃上增殖

為更好地了解這些表面支持細(xì)胞生長的傾向，本研究評估了HCAEC在3天和5天后的增殖情況。未經(jīng)處理的玻璃和PDMS上發(fā)生了極少的細(xì)胞附著，因此這些樣品未包括在增殖研究中。正如預(yù)期的那樣，TC塑料在3天和5天內(nèi)強(qiáng)烈支持細(xì)胞增殖（圖5A-C）。然而，在PDMS上，無論是經(jīng)過O?等離子體處理還是APPJ處理，都未能支持細(xì)胞生長，即使經(jīng)過5天，表面上也只有少數(shù)細(xì)胞存在（圖5A-C）。相比之下，與O?等離子體和APPJ處理相比，經(jīng)過PAC處理的PDMS上的細(xì)胞增殖率提高了四倍（P < 0.05），顯示出與當(dāng)前金標(biāo)準(zhǔn)材料TC塑料相當(dāng)?shù)闹С旨?xì)胞生長能力。在玻璃基底上，總體上與附著實(shí)驗(yàn)類似，HCAEC的增殖率比處理相似的PDMS基底要高。雖然O?等離子體處理的玻璃與TC塑料表現(xiàn)相當(dāng)，但經(jīng)過PAC處理的玻璃上的細(xì)胞增殖率在3天內(nèi)比O?等離子體處理的玻璃高2.1倍（P < 0.05）（圖5C）。相比TC塑料，PAC和APPJ處理的玻璃基底上的細(xì)胞增殖率增加了1.1倍（P < 0.05）。雖然在第5天時(shí)，等離子體處理的玻璃基底之間沒有觀察到差異，但這是因?yàn)闃悠飞闲纬闪私七B續(xù)單層的細(xì)胞。這些結(jié)果表明，PAC處理有效地支持PDMS和玻璃基底上的細(xì)胞增殖，而APPJ處理在玻璃基底上促進(jìn)了最高程度的增殖。本研究還在類似條件下培養(yǎng)了人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HCASMCs），并獲得了相同的增殖趨勢。

圖5 PAC可促進(jìn)HCAEC在PDMS和玻璃基底上增殖，APPJ可促進(jìn)HCAEC在玻璃基底上增殖

PAC和APPJ處理促進(jìn)了HCAEC在動(dòng)脈芯片中的生長和功能

為確定使用PAC和APPJ處理共價(jià)固定纖維連接蛋白是否能夠支持微流控通道中的細(xì)胞行為的改善，利用這些等離子體處理方法開發(fā)了一種動(dòng)脈芯片系統(tǒng)。為此，對所有生長表面（玻璃和PDMS）進(jìn)行了相關(guān)等離子體處理（包括O?等離子體、PAC或APPJ）。以后，這些裝置被稱為O?等離子體、PAC或APPJ裝置（圖6A）。HCAEC在這些裝置中進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)灌注并在低剪切力（0.007 dyn/cm2）下培養(yǎng)3天。在沒有斑點(diǎn)蛋白功能化的裝置中，等離子體處理之間的細(xì)胞數(shù)量差異很?。▓D6B）。然而，在涂覆了斑點(diǎn)蛋白之后，在PAC（P < 0.001）和APPJ（P < 0.0001）裝置上存在至少1.6倍的細(xì)胞，與本研究的共價(jià)固定數(shù)據(jù)和斑點(diǎn)蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力一致（圖6C）。有趣的是，與O?等離子體處理的裝置相比，經(jīng)斑點(diǎn)蛋白涂層后，APPJ裝置和PAC裝置上的細(xì)胞數(shù)量更多（分別為P < 0.01和P < 0.0001），APPJ裝置上的細(xì)胞數(shù)量也比PAC裝置多1.3倍（P < 0.01）。盡管斑點(diǎn)蛋白在微流控中促進(jìn)了細(xì)胞增殖，但經(jīng)過斑點(diǎn)蛋白涂層的氧等離子體處理裝置與未涂層的PAC和APPJ裝置的細(xì)胞計(jì)數(shù)相當(dāng)（P > 0.05），突顯了這些新型等離子體處理方法在器官芯片平臺上的優(yōu)越性。

本研究還對CD31的表達(dá)進(jìn)行了定量分析。CD31是一種關(guān)鍵的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，在沒有斑點(diǎn)蛋白涂層的情況下，O?等離子體裝置上的HCAEC表達(dá)的CD31比PAC裝置少1.3倍（P < 0.01），但與APPJ裝置相比沒有差異，而且PAC和APPJ裝置之間的CD31水平相當(dāng)（P > 0.05）（圖6D）。在斑點(diǎn)蛋白功能化之后，所有三種裝置類型上的CD31水平都有所增加，但在處理之間沒有觀察到差異（P > 0.05）。與細(xì)胞增殖趨勢類似，未涂覆斑點(diǎn)蛋白的PAC和APPJ裝置中的HCAEC表達(dá)的CD31水平與涂覆斑點(diǎn)蛋白的氧等離子體裝置相當(dāng)（P > 0.05）。

圖6 PAC和APPJ治療可促進(jìn)HCAEC在芯片中的動(dòng)脈的生長和功能

PAC-APPJ混合裝置可改善低剪切力和冠狀動(dòng)脈剪切力條件下的內(nèi)皮化效果

根據(jù)衰老和生物活性結(jié)果，本研究得出結(jié)論：對于PDMS材料，PAC處理是最佳選擇；而對于玻璃基底，APPJ提供最佳結(jié)果。然而，只有APPJ處理的裝置才能提供足夠的穩(wěn)定性和結(jié)合強(qiáng)度，以用于涉及高流體流動(dòng)或剪切力的實(shí)驗(yàn)，這在許多器官芯片應(yīng)用中是必需的。通過將APPJ處理的玻璃與PAC處理的PDMS結(jié)合，本研究開發(fā)了一種混合微流控裝置，克服了PAC處理裝置的結(jié)合強(qiáng)度問題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的共價(jià)固定和所有表面上優(yōu)越的細(xì)胞生長。為了創(chuàng)建這種混合微流控裝置，PDMS鍵合表面被屏蔽，只暴露通道表面，然后該區(qū)域經(jīng)過PAC處理（圖7A）。然后，移除屏蔽層，并將底物經(jīng)過APPJ處理并與經(jīng)過APPJ處理的玻璃蓋片鍵合。由于鍵合是通過APPJ處理的表面進(jìn)行的，所以這種混合微流控裝置保持了這些鍵合的高強(qiáng)度，同時(shí)確保兩種底物相對于標(biāo)準(zhǔn)方法都提供了優(yōu)越的細(xì)胞增殖（圖7A）。使用XPS和厚度分析評估，發(fā)現(xiàn)PAC表面在APPJ處理后沒有顯著變化。

為評估混合微流控裝置在經(jīng)過斑點(diǎn)蛋白功能化后用于器官芯片應(yīng)用的潛力，將內(nèi)皮細(xì)胞的生長與經(jīng)過O?等離子體處理的裝置進(jìn)行了比較。在混合裝置中，發(fā)現(xiàn)在3天內(nèi)幾乎完全內(nèi)皮化，而在經(jīng)過O?等離子體處理的裝置中沒有觀察到這種情況（圖7B-D）。與傳統(tǒng)的O?等離子體裝置相比，混合裝置上的頂部PDMS（P < 0.05）和底部玻璃基底（P < 0.01）上的細(xì)胞數(shù)量更多，這與靜態(tài)增殖研究中觀察到的趨勢非常相似（圖5C），突顯了該平臺的優(yōu)越生物功能化。為了進(jìn)一步優(yōu)化其性能，本研究在冠狀剪切條件（12.7 dyn/cm2）下在混合裝置中培養(yǎng)HCAEC細(xì)胞3天，細(xì)胞在玻璃基底上形成了一層連續(xù)而有序的單層（這是典型的暴露于剪切力的內(nèi)皮細(xì)胞的特征），在頂部PDMS表面上幾乎完全內(nèi)皮化（圖7E）。相比之下，與頂部的PAC處理的PDMS相比，HCAEC在APPJ處理的玻璃表面上更加有序。與低剪切力裝置上相同的表面相比，兩種表面上的HCAEC都更加有序（P < 0.0001）（圖7F）。綜上所述，這些結(jié)果表明，本研究的混合微流控裝置能夠在低剪切力和冠狀剪切條件下實(shí)現(xiàn)微流控芯片的優(yōu)越內(nèi)皮化。

圖7 混合微流控裝置促進(jìn)芯片動(dòng)脈健康內(nèi)皮的形成

綜上所述，本研究開發(fā)了一種混合等離子體處理的微流控平臺，利用PAC和APPJ在微流控表面上共價(jià)固定生物分子，極大地改善了動(dòng)脈芯片中細(xì)胞的附著和增殖。本研究的系統(tǒng)具有與標(biāo)準(zhǔn)方法相當(dāng)?shù)逆I合強(qiáng)度，并且在PDMS上具有改善的老化特性。考慮到該平臺能夠在微流控系統(tǒng)中共價(jià)固定生物分子，本研究的技術(shù)可以應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域，包括即時(shí)診斷、實(shí)驗(yàn)室芯片，或不同的器官芯片模型系統(tǒng)。此外，本研究的技術(shù)的廣泛適用性還可以在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)以外的領(lǐng)域使用，例如進(jìn)行食品或環(huán)境中分子的傳感。

論文鏈接： https://doi.org/10.1002/adfm.202313664