定量相位顯微鏡(QPM)利用物波的相位信息,不僅可以提供相差圖像,還可以提供樣品三維形貌和折射率分布的定量信息。
更高的空間分辨率有利于解析樣本的更精細細節(jié)。然而,在設計顯微物鏡時,通常需要在更高的空間分辨率和更小的視場(FOV)之間取得平衡。結構照明顯微鏡(SIM)是一種寬視場、微創(chuàng)、超分辨率成像技術,可以將無法分辨的高頻信息降檔為系統(tǒng)支撐區(qū)域的低頻下降,如圖1所示。
圖 1
此外,SIM還被證明具有與共聚焦顯微鏡相當的光學切片能力。因此,SIM在生物醫(yī)學成像中得到了廣泛的應用,特別是活細胞的長期觀察動力學。到目前為止,具有結構照明的QPM已經使用光柵或空間光調制器(SLM)實現(xiàn),并且相位成像模式通常與其他成像模式(如熒光成像)隔離開來。因此,由于同一樣本缺乏多維信息,QPM的值受到限制。
在本文中,我們提出了一種基于DMD的光學顯微鏡,它集成了多種成像模式。首先,基于結構照明的QPM能夠在沒有熒光標記的情況下提供樣品的定量相位圖像。其次,相干SIM提供具有分辨率增強的未標記樣品的吸收/散射圖像。第三,該系統(tǒng)與熒光成像模式集成,可提供同一樣品的額外(功能/生化)信息。
系統(tǒng)原理
該系統(tǒng)的原理圖如圖2所示,使用二極管激光器作為照明源。在依次被反射鏡M1和M2反射后,激光束被耦合到光纖中并發(fā)送到裝置。在輸出端,來自光纖的光被鏡頭L1準直,并由反射鏡M3引導至DMD(UPOLabs的HDSLM756D空間光調制器,1920×1080像素,像素大小7.56μm),入射角為24°。在DMD上,兩組具有正交方向和五相位移的條紋圖案依次加載到DMD中。DMD上顯示的條紋圖案由望遠鏡系統(tǒng)L2-L3和L4-MO1進一步中繼,并最終投射到放置在MO1和MO2公共焦平面上的樣品上。
在條紋照明下,然后由望遠鏡系統(tǒng)MO2-L5將樣品成像到圖像平面。相機CCD1記錄不同成像模式的衍射圖像,qDIC中的散焦圖像和相干SIM中的聚焦圖像。同時,來自樣品的發(fā)射光(熒光)將沿照明光的相反方向傳播,然后被相機CCD2收集。相機CCD1和CCD2與DMD同步,產生每秒15幀的采集速度,為每個通道提供亞秒級的成像速度。
圖 2
實驗與結果
qDIC活細胞顯微鏡成像
在第一個實驗中,進行了驗證性實驗,以證明在沒有熒光標記的情況下對活樣品成像的qDIC。為此,使用活小鼠脂肪干細胞作為相樣。實驗結果如圖3所示,通過比較表明,qDIC不僅可以可視化高對比度的透明樣品,還可以為我們提供樣品光程差(OPD)的定量信息。
圖 3 小鼠脂肪干細胞的qDIC成像。
SiO2 顆粒的相干 SIM 成像
在第二個實驗中,通過對SiO2磁珠(直徑:500 nm)進行成像,證明了使用相干結構照明的分辨率增強非熒光/散射成像。實驗結果如圖4所示.很明顯,相干結構照明在SiO2磁珠上提供了高分辨率圖像。
圖 4 500nm SiO2 磁珠的相干 SIM 成像。
百合花藥的雙模態(tài)(散射/熒光)成像
在第三個實驗中,以百合花藥為樣本,展示了所提出的SIM裝置的雙模態(tài)(非熒光散射/熒光)成像能力。實驗結果如圖5所示.熒光圖像經彩色濾光片濾波后由相機CCD2捕獲,與使用均勻照明獲得的寬視場圖像相比,SIM圖像顯示出更詳細的結構和更清晰的背景。此外,熒光圖像在干凈的背景中顯示了清晰的花粉結構(具有自發(fā)熒光)。SIM圖像(透射)和熒光圖像(反射)對于同一樣品具有相反的對比度,這一點也很明顯。
圖 5 百合花藥的雙模態(tài)成像。
審核編輯:劉清
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原文標題:用于定量相位和散射成像的透射結構照明顯微鏡
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