用于定量相位和散射成像的透射結構照明顯微鏡

定量相位顯微鏡（QPM）利用物波的相位信息，不僅可以提供相差圖像，還可以提供樣品三維形貌和折射率分布的定量信息。

更高的空間分辨率有利于解析樣本的更精細細節(jié)。然而，在設計顯微物鏡時，通常需要在更高的空間分辨率和更小的視場（FOV）之間取得平衡。結構照明顯微鏡（SIM）是一種寬視場、微創(chuàng)、超分辨率成像技術，可以將無法分辨的高頻信息降檔為系統(tǒng)支撐區(qū)域的低頻下降，如圖1所示。

圖 1

此外，SIM還被證明具有與共聚焦顯微鏡相當的光學切片能力。因此，SIM在生物醫(yī)學成像中得到了廣泛的應用，特別是活細胞的長期觀察動力學。到目前為止，具有結構照明的QPM已經使用光柵或空間光調制器（SLM）實現，并且相位成像模式通常與其他成像模式（如熒光成像）隔離開來。因此，由于同一樣本缺乏多維信息，QPM的值受到限制。

在本文中，我們提出了一種基于DMD的光學顯微鏡，它集成了多種成像模式。首先，基于結構照明的QPM能夠在沒有熒光標記的情況下提供樣品的定量相位圖像。其次，相干SIM提供具有分辨率增強的未標記樣品的吸收/散射圖像。第三，該系統(tǒng)與熒光成像模式集成，可提供同一樣品的額外（功能/生化）信息。

系統(tǒng)原理

該系統(tǒng)的原理圖如圖2所示，使用二極管激光器作為照明源。在依次被反射鏡M1和M2反射后，激光束被耦合到光纖中并發(fā)送到裝置。在輸出端，來自光纖的光被鏡頭L1準直，并由反射鏡M3引導至DMD（UPOLabs的HDSLM756D空間光調制器，1920×1080像素，像素大小7.56μm），入射角為24°。在DMD上，兩組具有正交方向和五相位移的條紋圖案依次加載到DMD中。DMD上顯示的條紋圖案由望遠鏡系統(tǒng)L2-L3和L4-MO1進一步中繼，并最終投射到放置在MO1和MO2公共焦平面上的樣品上。

在條紋照明下，然后由望遠鏡系統(tǒng)MO2-L5將樣品成像到圖像平面。相機CCD1記錄不同成像模式的衍射圖像，qDIC中的散焦圖像和相干SIM中的聚焦圖像。同時，來自樣品的發(fā)射光（熒光）將沿照明光的相反方向傳播，然后被相機CCD2收集。相機CCD1和CCD2與DMD同步，產生每秒15幀的采集速度，為每個通道提供亞秒級的成像速度。

圖 2

實驗與結果

qDIC活細胞顯微鏡成像

在第一個實驗中，進行了驗證性實驗，以證明在沒有熒光標記的情況下對活樣品成像的qDIC。為此，使用活小鼠脂肪干細胞作為相樣。實驗結果如圖3所示，通過比較表明，qDIC不僅可以可視化高對比度的透明樣品，還可以為我們提供樣品光程差（OPD）的定量信息。

圖 3 小鼠脂肪干細胞的qDIC成像。

SiO2 顆粒的相干 SIM 成像

在第二個實驗中，通過對SiO2磁珠（直徑：500 nm）進行成像，證明了使用相干結構照明的分辨率增強非熒光/散射成像。實驗結果如圖4所示.很明顯，相干結構照明在SiO2磁珠上提供了高分辨率圖像。

圖 4 500nm SiO2 磁珠的相干 SIM 成像。

百合花藥的雙模態(tài)（散射/熒光）成像

在第三個實驗中，以百合花藥為樣本，展示了所提出的SIM裝置的雙模態(tài)（非熒光散射/熒光）成像能力。實驗結果如圖5所示.熒光圖像經彩色濾光片濾波后由相機CCD2捕獲，與使用均勻照明獲得的寬視場圖像相比，SIM圖像顯示出更詳細的結構和更清晰的背景。此外，熒光圖像在干凈的背景中顯示了清晰的花粉結構（具有自發(fā)熒光）。SIM圖像（透射）和熒光圖像（反射）對于同一樣品具有相反的對比度，這一點也很明顯。

圖 5 百合花藥的雙模態(tài)成像。

審核編輯：劉清