超微量分光光度計(jì)檢測(cè)方法研究

摘要：超微量分光光度計(jì)目前成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。應(yīng)用液體的表面張力特性，檢測(cè)時(shí)經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑，達(dá)到快速、微量、高濃度檢測(cè)吸光度的特點(diǎn)。本文闡述了如何用現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)超微量分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，并舉例說(shuō)明對(duì)超微量分光光度計(jì)透射比、波長(zhǎng)和雜散光等主要指標(biāo)檢測(cè)方法。最后對(duì)超微量分光光度計(jì)日常檢測(cè)過(guò)程中可能遇到的問(wèn)題并對(duì)其進(jìn)行分析。

分光光度計(jì)是一類(lèi)重要的分析儀器，無(wú)論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域 ，還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門(mén) ，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)都有廣泛而重要的應(yīng)用。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。由于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量樣本量很小，于是超微量分光光度計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。

目前超微量分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器，應(yīng)用液體的表面張力特性，樣品體積只需要0. 5～2μL，在檢測(cè)臺(tái)上，經(jīng)上下臂的接觸拉出固定的光徑達(dá)到快速、微量、高濃度及不用石英管、毛細(xì)管等耗材檢測(cè)吸光度的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)等領(lǐng)域。

超微量分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成，與傳統(tǒng)分光光度計(jì)有明顯的不同。二者有以下7點(diǎn)區(qū)別:

(1)所需樣品體積小，僅需0.5～2μL;

(2)不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到檢測(cè)平臺(tái)上，測(cè)量時(shí)樣品自動(dòng)形成液柱，檢測(cè)完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測(cè)平臺(tái)上擦拭干凈即可;

(3)一般具有1mm和0.2mm兩個(gè)光程(電機(jī)控制自動(dòng)選擇)，而傳統(tǒng)分光光度計(jì)的光程為10mm，分光光度計(jì)樣品無(wú)需稀釋?zhuān)瑴y(cè)量范圍可達(dá)到常規(guī)分光光度計(jì)的50倍;

(4)氙氣閃光燈為燈源，代替了氘燈(紫外)和鎢燈(可見(jiàn))，使用壽命更長(zhǎng);

(5)不需要預(yù)熱，可隨時(shí)檢測(cè);

(6)顯示吸光度值的同時(shí)，程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料);

(7)體積比傳統(tǒng)分光光度計(jì)小很多(用體積數(shù)值表述)。

超微量分光光度計(jì)與傳統(tǒng)的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)工作原理相同，都是根據(jù)物質(zhì)的分子對(duì)紫外、可見(jiàn)區(qū)輻射(光)的選擇性吸收和朗伯－比爾(Lambert－Beer)定律對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析和定性鑒別的儀器。

朗伯 － 比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

A = -lg(I/I 0 )= -lgT = klc

式中:A—物質(zhì)的吸光度;

I 0 —入射的單色光強(qiáng)度;

I—透射的單色光強(qiáng)度;

T—物質(zhì)的透射比;

k—物質(zhì)的吸光系數(shù);

l—被分析物質(zhì)的光程;

c—物質(zhì)的濃度。

由此可見(jiàn)，單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光程)成正比。物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸光度，即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。

現(xiàn)行的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢定依據(jù)為 JJG178－2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程。其中規(guī)定透射比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.06000/1000重鉻酸鉀的0.001mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在 235nm、257nm、313nm、350nm處測(cè)量透射比三次。重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液在相應(yīng)波長(zhǎng)下不同溫度的透射比值如表 1所示。

超微量分光光度計(jì)檢測(cè)方法

透射比準(zhǔn)確度和重復(fù)性的測(cè)量

分別在235nm、257nm、313nm、350nm處，將重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液［紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW(E)130066］作為樣本進(jìn)行測(cè)量。

首先，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)結(jié)果為吸光度值，然而紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液)證書(shū)的特性量值用透射比表示。其次，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)光徑為1mm或0.2mm，和紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)內(nèi)徑為10nm的標(biāo)準(zhǔn)石英吸收池定值條件并不一致。這樣就需要對(duì)所測(cè)出的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

由朗伯－比爾定律 A = klc可知，被測(cè)物質(zhì)的光程和吸光度值成正比，可將超微量分光光度計(jì)波長(zhǎng)為313nm時(shí)，光徑為1mm的吸光度值0. 030，擴(kuò)大10倍，轉(zhuǎn)化成光徑為10mm的吸光度值為0.300。同理，光徑為 0.2mm的吸光度值0. 006，擴(kuò)大50倍，轉(zhuǎn)化成光徑10mm的吸光度值也為0.300。又根據(jù)朗伯－比爾定律 A =-lgT，可得 T =10-A。超微量分光光度計(jì)波長(zhǎng)為 313nm時(shí)，T =10-0. 300=50. 1%。

依據(jù) JJG178－2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程要求，分別在 235nm、257nm、313nm、350nm處測(cè)量透射比三次。透射比最大允許誤差≤ ±2.0%，透射比重復(fù)性≤1.0%，符合Ⅳ級(jí)儀器指標(biāo)要求。

波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的測(cè)量

掃描氧化鈥的光譜曲線，依次查找 200nm～900nm的指定波長(zhǎng)，配合圖譜下方的數(shù)據(jù)列表，找出氧化鈥光譜曲線的波峰值(與其對(duì)應(yīng)的則是光譜曲線透射比的波谷值)。

依據(jù) JJG178－2007 規(guī)程的計(jì)量性能要求，波長(zhǎng)在200nm～340nm區(qū)段，最大允許誤差≤±2nm，波長(zhǎng)在340nm～900nm區(qū)段，最大允許誤差≤± 4nm，波長(zhǎng)重復(fù)性≤1nm，符合Ⅳ級(jí)儀器指標(biāo)要求。

雜散光的測(cè)量

測(cè)量生化分析儀校準(zhǔn)用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(BW2025)中的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(注:溶液濃度為 50g/L)根據(jù)朗伯 － 比爾定律，先將儀器測(cè)量的吸光度值轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm的吸光度值:A 10nm = 10A 1nm = 1. 412×10 =14. 12。超微量分光光度計(jì)波長(zhǎng)為 340nm時(shí)雜散光的結(jié)果，轉(zhuǎn)化成 T =10－A=10－14. 12=0. 0%。依據(jù) JJG178－2007規(guī)程的計(jì)量性能要求，儀器雜散光(透射比)≤0. 1%，符合Ⅰ級(jí)儀器指標(biāo)要求。

常見(jiàn)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)中的問(wèn)題及分析

超微量分光光度計(jì)的零點(diǎn)漂移

用紫外分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液)檢測(cè)儀器透射比準(zhǔn)確度，分別設(shè)置235nm、257nm、313nm、350nm四點(diǎn)波長(zhǎng)，以空白溶液為參比，在對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下調(diào)零后，用紫外分光標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量被測(cè)儀器的透射比。

測(cè)量結(jié)果與紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)透射比差別較大，且連續(xù)測(cè)量3次，對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響不大。

經(jīng)過(guò)測(cè)量結(jié)果數(shù)據(jù)分析，儀器經(jīng)轉(zhuǎn)化后的透射比結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)值小，得出吸光度值原始測(cè)量結(jié)果則比吸光度的標(biāo)準(zhǔn)值大，其中發(fā)現(xiàn)吸光度的誤差變化成線性，且誤差均是 0.10。

這樣將標(biāo)準(zhǔn)空白溶液當(dāng)成樣本，測(cè)量空白溶液吸光度值，發(fā)現(xiàn)空白溶液的吸光度值為 0. 010(被測(cè)儀器的光徑為 1mm)。轉(zhuǎn)化成光徑為 10mm的吸光度對(duì)應(yīng)正好也就相差 0. 10。這種方法可以測(cè)量出該儀器的零點(diǎn)漂移。把儀器的吸光度的本底減去后符合朗伯 － 比爾定律。

結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)上述的檢測(cè)方法闡述和問(wèn)題分析，對(duì)判斷超微量分光光度計(jì)的計(jì)量性能有了更加可行的手段和方法。依據(jù) JJG178－ 2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》中的要求，并沒(méi)有規(guī)定對(duì)超微量分光光度計(jì)有效的檢測(cè)方法。因此結(jié)合計(jì)量部門(mén)的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)一套有效的檢測(cè)方法，使得計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)得到有效的量值傳遞，也同時(shí)解決了超微量分光光度計(jì)此前無(wú)法量值溯源問(wèn)題，是值得在今后的工作中加以推廣并完善的。

審核編輯 黃宇