利用粘彈性微流控系統(tǒng)，直接從人體血液中分離小細(xì)胞外囊泡

小細(xì)胞外囊泡（sEVs；< 200 nm）中含有脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是多種疾病的生物標(biāo)志物，具有良好的應(yīng)用前景。然而，從血液中分離小細(xì)胞外囊泡的常規(guī)方法與目前的臨床工作流程不兼容，因此嚴(yán)重阻礙了血源性小細(xì)胞外囊泡在臨床環(huán)境中的應(yīng)用。在過(guò)去的十多年中，由于能夠精確、可控地操縱微米級(jí)和納米級(jí)尺寸的物體，微流控技術(shù)已經(jīng)被越來(lái)越多地被用作小細(xì)胞外囊泡處理和分離的基本工具。根據(jù)分離模式的不同，基于微流控技術(shù)的小細(xì)胞外囊泡分離策略可以分為被動(dòng)和主動(dòng)兩類(lèi)。其中，被動(dòng)分離方法不需要施加外力，而是通過(guò)使用尺寸依賴的流體動(dòng)力或復(fù)雜的通道結(jié)構(gòu)（例如納米孔膜和納米柱陣列）來(lái)分離小細(xì)胞外囊泡。相反，主動(dòng)分離方法需要應(yīng)用外力場(chǎng)，尤其是聲場(chǎng)、電場(chǎng)和磁場(chǎng)來(lái)操縱小細(xì)胞外囊泡。

在臨床環(huán)境中，迫切需要制造成本低廉、操作簡(jiǎn)單、不需要專(zhuān)業(yè)知識(shí)、樣品制備步驟少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的一致性和可重復(fù)性，同時(shí)具有高分離純度和回收率的細(xì)胞外囊泡分離系統(tǒng)。上述分離血源性小細(xì)胞外囊泡的主動(dòng)技術(shù)需要產(chǎn)生和應(yīng)用外力，這就需要使用外部設(shè)備，這反過(guò)來(lái)又增加了處理成本并使實(shí)驗(yàn)工作流程復(fù)雜化。相對(duì)地，從全血中分離小細(xì)胞外囊泡的被動(dòng)微流控方法在成本、易用性和可重復(fù)性方面具有優(yōu)勢(shì)，但其并非沒(méi)有局限性。例如，基于過(guò)濾的微流控平臺(tái)容易受到膜堵塞的影響，而其它被動(dòng)技術(shù)，如基于慣性和粘彈性的微流控技術(shù)，則表現(xiàn)出次優(yōu)的回收率和純度。在臨床環(huán)境中，除了考慮與經(jīng)濟(jì)性和用戶友好性有關(guān)的因素外，實(shí)現(xiàn)小細(xì)胞外囊泡的高回收率和高純度至關(guān)重要，特別是在僅可以獲得少量生物液體的情況下。因此，對(duì)能夠快速、可重復(fù)、高效地從全血中分離小細(xì)胞外囊泡的高效、簡(jiǎn)單、低成本的微流控工具的需求尚未得到滿足。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，為了解決上述問(wèn)題，近期，來(lái)自瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院（ETH Zurich）、蘇黎世大學(xué)（University of Zürich）和蘇黎世大學(xué)醫(yī)院（University Hospital Zurich）的研究人員提出了一種被動(dòng)、高效、粘彈性和無(wú)標(biāo)簽的微流控系統(tǒng)，其能夠直接從人體血液中分離小細(xì)胞外囊泡。此外，研究人員利用從全血中分離獲得的熒光小細(xì)胞外囊泡對(duì)該微流控系統(tǒng)的分離性能進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，其純度和回收率分別超過(guò)97%和87%。相關(guān)研究成果以“Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood usingviscoelastic microfluidics”為題發(fā)表在Science Advances期刊上。

具體而言，該集成式粘彈性微流控系統(tǒng)包括兩個(gè)模塊：細(xì)胞去除模塊和小細(xì)胞外囊泡分離模塊（圖1A）。在第一個(gè)模塊中，微米級(jí)血液成分，特別是白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板，被有效地從血液樣本中去除。隨后，“無(wú)細(xì)胞”的血液被無(wú)縫地引入第二個(gè)模塊，并在這里實(shí)現(xiàn)小細(xì)胞外囊泡與其它細(xì)胞外囊泡亞群的分離。

圖1 用于全血小細(xì)胞外囊泡分離的粘彈性微流控系統(tǒng)示意圖

圖2 利用粘彈性微流控系統(tǒng)對(duì)從全血中分離獲得的小細(xì)胞外囊泡進(jìn)行表征

為了進(jìn)一步研究和比較利用超速離心法（UC，小細(xì)胞外囊泡分離的金標(biāo)準(zhǔn)）和粘彈性微流控系統(tǒng)分離的血源性小細(xì)胞外囊泡樣品的蛋白質(zhì)組成，研究人員提取了兩種小細(xì)胞外囊泡樣品中的蛋白質(zhì)，并使用數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）和平行累積連續(xù)碎裂（PASEF）方法進(jìn)行了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。分析結(jié)果證實(shí)，利用粘彈性微流控系統(tǒng)獲取的小細(xì)胞外囊泡在蛋白質(zhì)組成方面表現(xiàn)出與金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法的相似性能。

圖3 基于質(zhì)譜法檢測(cè)的細(xì)胞外囊泡相關(guān)蛋白的通路ORA分析

隨后，為了證明該粘彈性微流控系統(tǒng)在臨床液體活檢中的有效性，研究人員從20名癌癥患者（CPs）和20名健康捐獻(xiàn)者（HDs）的血液中分離出小細(xì)胞外囊泡，并將其濃度和尺寸與通過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。值得注意的是，與金標(biāo)準(zhǔn)超速離心法相比，基于粘彈性微流控系統(tǒng)的方法顯著提高了小細(xì)胞外囊泡的獲取率。

最后，研究人員利用從10例健康捐獻(xiàn)者的血液活檢樣本中獲得的小細(xì)胞外囊泡探索了其濃度和尺寸與血液儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系。作為血液老化過(guò)程的一部分，血細(xì)胞中會(huì)脫落小細(xì)胞外囊泡，因此，隨著時(shí)間的推移，血源性小細(xì)胞外囊泡的數(shù)量會(huì)增加。如圖5C所示，在29天的血液儲(chǔ)存期間，小細(xì)胞外囊泡的濃度顯著增加，從而證實(shí)了上述預(yù)測(cè)。此外，圖5D中的數(shù)據(jù)表明，在同一時(shí)間段內(nèi)，相比于濃度的變化，小細(xì)胞外囊泡尺寸的增加則更為緩慢（但可測(cè)量）。因此，上述觀察結(jié)果證實(shí)了該研究所開(kāi)發(fā)的粘彈性微流控系統(tǒng)在同步監(jiān)測(cè)血液質(zhì)量方面的潛力。

圖4 基于粘彈性微流控系統(tǒng)的液體活檢過(guò)程中分離獲得的小細(xì)胞外囊泡，用于癌癥診斷和監(jiān)測(cè)小細(xì)胞外囊泡的濃度和尺寸與血液儲(chǔ)存時(shí)間的關(guān)系

綜上所述，與現(xiàn)有的小細(xì)胞外囊泡分離技術(shù)相比，本文所提出的粘彈性微流控平臺(tái)具有低成本、易于操作、高小細(xì)胞外囊泡回收率和高純度的特點(diǎn)，可用于科研和臨床研究。

審核編輯：劉清