基于自組裝DNA納米孔的生物質(zhì)子器件制造

納米孔作為膜通道，能夠介導(dǎo)信息交換，促進(jìn)分子識(shí)別，然而，目前用于連接納米孔、進(jìn)行信號(hào)讀出的電子設(shè)備信息傳輸效率較低，這成為了繼續(xù)開發(fā)高性能生物電子器件的主要障礙之一。

來(lái)自加州大學(xué)圣克魯斯分校的Marco Rolandi和來(lái)自麻省理工學(xué)院的Ashwin Gopinath團(tuán)隊(duì)將DNA納米孔與生物質(zhì)子電極相結(jié)合，以創(chuàng)建可編程的、模塊化的、高效的人工離子通道接口。研究表明，膽固醇修飾的DNA納米孔具有顯著的親和力，能夠跨越平面生物質(zhì)子電極表面形成的脂雙層，介導(dǎo)質(zhì)子在脂雙層上的傳輸，識(shí)別生物分子信號(hào)。該工作以“DNA nanopores as artificial membrane channels forbioprotonics”為題，發(fā)表在Nature Communication期刊上。

首先，研究人員將合成的基于自組裝DNA納米孔的離子通道與H?選擇性鈀（Pd）電極結(jié)合在一起，創(chuàng)造了一種生物質(zhì)子器件，該器件可以記錄和調(diào)節(jié)穿過雙層膜的H?電流（圖1）。如圖1所示，DNA納米孔跨越脂質(zhì)雙層膜，該膜位于與微流控結(jié)構(gòu)集成的Pd觸點(diǎn)頂部。

由于極性變化，Pd觸點(diǎn)和溶液中的Ag/AgCl參比電極之間的電壓（VH?）會(huì)在Pd觸點(diǎn)和溶液之間產(chǎn)生H?的流動(dòng)，H?的流動(dòng)會(huì)誘導(dǎo)PdHx的電化學(xué)形成（或溶解），從而在電子電路中產(chǎn)生可測(cè)量的電流（IH?），研究人員使用該方法來(lái)測(cè)量由于離子通道插入和活性變化而導(dǎo)致的膜電導(dǎo)變化。

接著，為了創(chuàng)建仿生離子通道，使H?能夠在脂雙層上轉(zhuǎn)移，研究人員通過自下而上的合理設(shè)計(jì)，用等摩爾量的13條短ssDNA鏈自組裝成6個(gè)相互連接的螺旋束（6HB），形成了一個(gè)14 nm長(zhǎng)的具有中空管腔的納米桶狀結(jié)構(gòu)。然后，研究人員用四乙二醇-膽固醇（TEG-Chol）將DNA納米孔功能化，為親水性DNA納米孔插入到脂雙層的疏水環(huán)境提供錨點(diǎn)，進(jìn)一步表征確定了納米孔的尺寸、穩(wěn)定性及孔徑。

圖1 生物質(zhì)子器件原理圖

為了驗(yàn)證DNA納米孔離子通道確實(shí)是H?導(dǎo)體，研究人員測(cè)量了DNA生物電子器件中IH?對(duì)VH?的依賴性。首先，研究人員驗(yàn)證了裸Pd接觸在溶液界面對(duì)H?的轉(zhuǎn)移，并記錄IH?作為VH?的函數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VH?的變化促使了H?在PdHx和溶液之間的轉(zhuǎn)移。

其次，研究人員證實(shí)了脂雙層會(huì)產(chǎn)生屏障并阻止H?從溶液轉(zhuǎn)移到Pd表面。研究人員測(cè)量了H?通過納米孔的轉(zhuǎn)移，測(cè)量電流表明，只有極少的H?穿過了雙層膜并在Pd表面減少，這可能是由于表面缺陷造成的。接著，研究人員在溶液中加入兩個(gè)膽固醇處理修飾的DNA納米孔（6HB-2C）后，研究人員預(yù)計(jì)DNA納米孔會(huì)自發(fā)插入脂質(zhì)雙分子層，形成跨膜離子通道，但具有一個(gè)或三個(gè)膽固醇修飾的納米孔（6HB-1C和6HB-3C）不能插入脂雙層，這主要是由于疏水性需要控制在一定范圍所導(dǎo)致的。

如圖2b所示，納米孔的這種插入導(dǎo)致VH?= - 400 mV時(shí)的IH?遠(yuǎn)大于脂雙層涂層，表明DNA納米孔為H?在脂雙層上移動(dòng)提供了途徑。為了避免質(zhì)子在Pd接觸點(diǎn)上的積累，在第二階段中，研究人員將VH?設(shè)置為0 mV。比電解質(zhì)更高的光化學(xué)勢(shì)導(dǎo)致質(zhì)子釋放到電解質(zhì)中并帶正IH?。如圖2b右所示，未經(jīng)膽固醇處理的DNA納米孔沒有插入到脂雙層中，這一點(diǎn)得到了裸脂雙層觀察到的IH?的證實(shí)。

圖2 膜跨越DNA納米孔調(diào)控H?的示意圖

隨后，研究人員通過設(shè)計(jì)DNA序列編程DNA納米孔所需的功能，分別使用體外SELEX技術(shù)選擇生物素或DNA適配體（AP）處理納米孔，用于檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)鏈親和素（S-avidin）和心臟生物標(biāo)志物B-type natriuretic peptide（BNP）。為此，研究人員在5'端分別用生物素或AP修飾ssDNA，進(jìn)而功能化6HB-2C納米孔，進(jìn)行DNA雜交，以獲得6HB-2C-2B和6HB-2C-2AP。正如預(yù)期的那樣，插入到脂雙層6HB-2C-2B納米孔在VH?= -400 mV時(shí)產(chǎn)生了較大的集成電流IH?，這表明DNA納米孔內(nèi)的納米桶結(jié)構(gòu)有助于H?通過脂雙層運(yùn)輸。然而，當(dāng)親和素以5倍于納米孔濃度的過量濃度引入環(huán)境時(shí)，親和素與生物素在DNA納米孔上的結(jié)合事件有效地阻塞了納米管，阻礙了H?在脂雙層上的運(yùn)輸，這可以通過IH?的減少來(lái)表明。

為了證實(shí)親和素確實(shí)阻斷了DNA結(jié)構(gòu)周圍的孔，研究人員將非生物素化的6HB-2C暴露于溶液中相同濃度的親和素中，并在加入蛋白質(zhì)前后進(jìn)行了熒光成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明親和素與生物素的結(jié)合確實(shí)阻斷了通道并導(dǎo)致集合電流降低。隨著親和素濃度的增加，更多的納米孔與親和素相互作用，導(dǎo)致更多的通道堵塞，電流下降。

然后，研究人員用6HB-2C-2AP納米孔進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)和對(duì)照。與生物素標(biāo)記的納米孔一樣，DNA適體標(biāo)記的納米孔插入脂雙層中形成跨膜離子通道，并導(dǎo)致H?的運(yùn)輸。當(dāng)BNP蛋白以5倍于納米孔濃度的濃度被引入環(huán)境時(shí)，在VH?= -400 mV時(shí)，觀察到IH?降低。這表明AP-BNP在離子通道邊緣的親和相互作用阻斷了H?的轉(zhuǎn)運(yùn)。與生物素-親和素相比，AP-BNP的電流降低幅度較小，這是由于其相互作用的親和力較弱。

圖3 生物素-鏈親和素和適配體-肽的生物質(zhì)子器件示意圖

最后，為了更好地理解DNA納米孔插入脂雙層的動(dòng)力學(xué)，研究人員建立了一個(gè)基于Langmuir方程和吸收/解吸動(dòng)力學(xué)的模型來(lái)分析DNA納米孔在脂質(zhì)雙分子層中的插入過程，測(cè)定了IH?與引入的6HB-2C濃度、納米孔數(shù)與引入6HB-2C濃度、IH?與納米孔數(shù)及IH?與時(shí)間的曲線。

圖4 DNA納米孔表征示意圖

綜上所述，研究人員展示了一種可編程的生物質(zhì)子器件，它具有跨膜DNA納米孔離子通道作為分子互連通道，可以測(cè)量和控制H?在脂質(zhì)雙分子層界面上的轉(zhuǎn)移。該方法的特點(diǎn)如下：

（1）能夠利用DNA結(jié)構(gòu)的可編程性來(lái)設(shè)計(jì)納米孔并修改其表面，以電子的方式在體外感知特定的生物分子，而無(wú)需對(duì)生物分子進(jìn)行額外的預(yù)處理；

（2）該方法可以同時(shí)收集來(lái)自多個(gè)通道的響應(yīng)，集成方法補(bǔ)償了單個(gè)通道記錄中的任何變異性或異常值，從而使數(shù)據(jù)更加一致可靠；

（3）消除了與單分子器件相關(guān)的高精度設(shè)備和個(gè)性化定制的必要，簡(jiǎn)化了器件制造和信號(hào)記錄過程。同時(shí)，該研究進(jìn)行了集成實(shí)驗(yàn)，建立了動(dòng)態(tài)模型，探索了這種DNA納米孔結(jié)構(gòu)在生物傳感領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

審核編輯：劉清