用于促進(jìn)生物膜清除和糖尿病傷口愈合的多酶級(jí)聯(lián)雙層微針?lè)磻?yīng)系統(tǒng)

生物膜的存在仍然是慢性傷口愈合的重要障礙，包括糖尿病傷口。生物膜的胞外聚合物（EPS）屏障致密，導(dǎo)致藥物滲透性差，使生物膜的清除成為一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。此外，高葡萄糖水平會(huì)阻礙傷口愈合的過(guò)程。

近日，西北大學(xué)范代娣教授團(tuán)隊(duì)首次將酶生物膜破壞與基于氧化石墨烯的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療（CDT）相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種多酶級(jí)聯(lián)微針（MN）系統(tǒng)。微針尖快速溶解，并將α-淀粉酶和葡萄糖氧化酶負(fù)載的金屬有機(jī)框架MIL-101 （M@G）輸送到生物膜內(nèi)部。α-淀粉酶分解EPS結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌變得脆弱，并產(chǎn)生葡萄糖作為下一個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的底物。

接下來(lái)，Gox利用EPS降解產(chǎn)生的葡萄糖，在傷口部位產(chǎn)生大量的H?O?，然后通過(guò)MIL-101轉(zhuǎn)化為活性氧（ROS）。該系統(tǒng)通過(guò)順序破壞EPS，在傷口處消耗葡萄糖，并自供H?O?產(chǎn)生ROS來(lái)清除耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物膜，從而降低葡萄糖濃度，同時(shí)減少細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)。

此外，促血管生成肽功能化水凝膠（Gel-Q-M）作為支持促進(jìn)膠原沉積和血管生成，從而加速慢性傷口愈合。因此，構(gòu)建的微針平臺(tái)在體外具有良好的抗生物膜和血管生成性能，可以有效清除生物膜，減少炎癥，促進(jìn)糖尿病傷口愈合。相關(guān)論文以“Amulti-enzyme cascade microneedle reaction system for hierarchically MRSAbiofilm elimination and diabetic wound healing”為題發(fā)表在ChemicalEngineering Journal期刊上。

考慮到糖尿病傷口中的血管阻塞和肉芽組織再生，該研究使用接枝有促血管生成肽QHREDGS的明膠水凝膠作為微針的背襯層。在傷口愈合階段釋放多肽可促進(jìn)血管新生以及膠原沉積?？傊?，雙層微針設(shè)計(jì)考慮了傷口愈合的不同階段，通過(guò)分級(jí)破壞EPS，降低傷口處的葡萄糖濃度，自我供應(yīng)H?O?以產(chǎn)生ROS，并釋放肽以促進(jìn)血管生成，提供了解決生物膜感染和慢性傷口愈合的有前景的戰(zhàn)略平臺(tái)（圖1）。

圖1 多酶級(jí)聯(lián)雙層微針貼片清除MRSA生物膜，并促進(jìn)糖尿病傷口愈合的示意圖

隨后，研究人員利用TEM、SEM、Zeta和XPS等多種方法對(duì)MIL-101和M@G表征進(jìn)行了系統(tǒng)性地分析。

圖2 材料的表征

此外，研究人員對(duì)合成的MIL-101的芬頓活性進(jìn)行了驗(yàn)證。用TMB比色法檢測(cè)不同條件下羥基自由基的產(chǎn)生。無(wú)色的TMB可被羥基自由基氧化成藍(lán)色，在652 nm處顯示出清晰的吸收峰。如圖3D，在不存在H?O?的情況下，羥基自由基的產(chǎn)生幾乎檢測(cè)不到。加入H?O?后，在酸性溶液中羥基自由基的產(chǎn)生量遠(yuǎn)高于中性溶液，表明合成的MIL-101具有優(yōu)異的芬頓活性，酸性條件能顯著增強(qiáng)活性氧的產(chǎn)生。在負(fù)載Gox之后，評(píng)估在葡萄糖存在下M@G的級(jí)聯(lián)催化效應(yīng)。如圖在相同濃度的M@G下，隨著葡萄糖濃度的增加，·OH在652 nm處的吸收峰顯著增大。

接下來(lái)，研究人員使用實(shí)時(shí)pH計(jì)、TMB法和ESR測(cè)量驗(yàn)證了級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中pH的變化和H?O?和·OH的形成。如圖3F，溶液的pH在12小時(shí)內(nèi)從5.8繼續(xù)降低至4.2。此外，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，中間體H?O?的產(chǎn)生逐漸增加（圖3G）。同時(shí)，M@G的濃度越高，葡萄糖消耗越多（圖3H），產(chǎn)生的H?O?越多。結(jié)果表明，葡萄糖可以連續(xù)氧化生成葡萄糖酸和H?O?，pH的降低和過(guò)氧化氫的產(chǎn)生也為MIL-101催化芬頓反應(yīng)提供了適宜的酸性環(huán)境和底物。其次，以5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）為捕集劑，用ESR方法驗(yàn)證了反應(yīng)體系中·OH的生成。如圖3I所示，·OH的典型的1：2：2：1特征峰譜，峰強(qiáng)度隨葡萄糖濃度的增加而擴(kuò)大，表明級(jí)聯(lián)反應(yīng)成功地產(chǎn)生了羥基自由基。上述結(jié)果表明，所構(gòu)建的M@G納米粒子可以通過(guò)自身供給的H?O?和葡萄糖誘導(dǎo)的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。

圖3 MIL-101與M@G的催化活性表征

整個(gè)雙層微針貼片（WMN）由10 × 10的針尖陣列組成，并且背襯是直徑為1 cm的圓形。SEM圖像顯示尖端是均勻的和金字塔形的（高度約700 μm，基部直徑約300 μm，針間距約300 μm）。為了驗(yàn)證該微針貼片的機(jī)械性能，將含有羅丹明B染料的微針應(yīng)用于離體新鮮大鼠皮膚。插入后3分鐘移除背襯部分顯示出清晰的紅點(diǎn)陣列（圖4F）和相應(yīng)的皮膚H&E染色。圖4G還顯示出了針尖的形狀，證明針尖成功地插入皮膚中。壓縮試驗(yàn)進(jìn)一步用于測(cè)量微針的機(jī)械強(qiáng)度，在200 μm位移下，納米顆粒加載微針的機(jī)械強(qiáng)度略高于未加載微針，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。機(jī)械力為0.39 N/針，其足以穿透皮膚和生物膜（圖4H）。使用瓊脂糖模擬皮膚研究微針貼片的溶解。如圖4I，微針尖端在三分鐘內(nèi)逐漸溶解以快速釋放抗菌劑和抗生物膜劑。

從3 min~ 5 min，F(xiàn)e3?的累積釋放逐漸達(dá)到一個(gè)平臺(tái)，表明大部分負(fù)載M@G已被釋放，且少量增加可能是由于M@G位于尖端與背部界面連接處。為了觀察藥物的分布，以FITC標(biāo)記的Gel-Q-M為背襯，羅丹明B為模型藥物在針尖處，圖中的熒光圖像。4J顯示紅色熒光富集在尖端部位，而背襯顯示綠色熒光，表明兩種染料的均勻分布。此外，值得注意的是，背襯層的UV照射時(shí)間的選擇直接影響水凝膠的交聯(lián)程度，并因此影響肽的釋放。因此，肽從FITC標(biāo)記的Gel-Q-M微針貼片的釋放通過(guò)測(cè)量在不同UV照射時(shí)間下的熒光強(qiáng)度來(lái)表征。增加的交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)了肽釋放時(shí)間（圖4K）。

圖4 微針的制備與表征 鑒于M@G的優(yōu)異級(jí)聯(lián)催化作用和產(chǎn)生羥基自由基的能力，研究人員接下來(lái)驗(yàn)證了微針貼片的體外抗菌能力。圖5和圖6展示出了強(qiáng)大的抗菌能力和細(xì)菌生物膜清除能力。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（圖7）表明M@G也被證明具有優(yōu)異的生物相容性和促進(jìn)血管生成能力。

圖5 體外抗菌性能

圖6 微針體外生物膜清除能力

圖7 微針體外生物相容性及促血管生成能力的評(píng)價(jià)

接下來(lái)，研究人員通過(guò)在I型糖尿病大鼠的皮膚上構(gòu)建MRSA生物膜模型來(lái)評(píng)估微針貼片的體內(nèi)抗生物膜和傷口愈合能力（圖8）。在治療后第9天，雙層微針組的傷口面積顯著小于其他三組，并且傷口在第12天基本上完全閉合，這證明雙層微針貼片在促進(jìn)生物膜感染糖尿病傷口的傷口愈合中是有效的，這歸因于尖端的抗生物膜的協(xié)同作用和背襯層的血管生成作用。此外，多酶級(jí)聯(lián)降低了傷口部位的葡萄糖濃度，這也可能有助于加速傷口愈合。

圖8 微針體外生物相容性及促血管生成能力的評(píng)價(jià)

綜上所述，該研究將酶促生物膜破壞與Gox偶聯(lián)CDT結(jié)合構(gòu)建了微針系統(tǒng)，用于清除MRSA生物膜，促進(jìn)糖尿病傷口血管生成，加速傷口愈合。微針的尖端穿透生物膜，將負(fù)載轉(zhuǎn)移到內(nèi)部。釋放的α-淀粉酶為后續(xù)酶促反應(yīng)提供葡萄糖底物，同時(shí)降解EPS。

隨后，存在于傷口中的α-淀粉酶生成的葡萄糖被M@G的Gox氧化生成大量的H?O?，在M@G的芬頓作用下產(chǎn)生高毒性O(shè)H，清除生物膜。該系統(tǒng)可以產(chǎn)生自供的H?O?，而不需要添加外源H?O?。這不僅破壞了生物膜結(jié)構(gòu)，而且為級(jí)聯(lián)反應(yīng)提供了底物，在產(chǎn)生H?O?的同時(shí)降低了傷口中糖尿病的濃度，一舉兩得。此外，從背襯層逐漸釋放的促血管生成肽平衡了傷口愈合的組織重塑階段。通過(guò)將多種功能集成到微針貼片中，可以顯著改善生物膜感染糖尿病傷口的治療。

審核編輯：劉清