用于高效體外mRNA轉(zhuǎn)錄的具有微纖維通道的微流控生物反應(yīng)器

理想的微流控生物反應(yīng)器（MBR）應(yīng)具有高混合效率（ME）、快速混合、易于制造、低成本以及與反應(yīng)物和產(chǎn)物的低相互作用等關(guān)鍵特征。為了解決這些問題，來自韓國(guó)天主教大學(xué)的Sung-Wook Choi開發(fā)了一種新型全氟聚醚（PFPE）-MBR，使用一種簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)有效的方法進(jìn)行連續(xù)體外mRNA轉(zhuǎn)錄（圖1a）。具有兩個(gè)混合單元和長(zhǎng)大通道的MBR促進(jìn)引入成分的完全流體混合，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率的mRNA合成。同時(shí)，研究人員表明該微流控體外轉(zhuǎn)錄是使用微流控混合系統(tǒng)連續(xù)mRNA合成的首次演示。相關(guān)論文以“Microfluidic Bioreactor with Fibrous Micromixers for In Vitro mRNA Transcription”為題于近期發(fā)表在Nano Letters期刊上。

圖1 PDMS微混合器的制造過程示意圖

圖1a顯示了將3個(gè)聚二甲基硅氧烷（PDMS）層組裝成微流控裝置。具有入口/出口端口的頂層具有使用3D打印圖案作為模板制備的半圓形大通道（圖1b），中間層有一個(gè)由三個(gè)混合單元組成的微混合器。使用電紡微纖維盤作為模板制備具有纖維微通道的混合單元，從兩個(gè)入口引入的流體在頂層的大通道中相互接觸。隨后，液流經(jīng)過反復(fù)的混合單元和大通道，最終流出至出口。此外，大多數(shù)纖維微通道呈現(xiàn)出隨機(jī)彎曲的結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生旋流。此外，在微通道處可以清楚地觀察到許多連接纖維微通道的連接點(diǎn)（圖1c）。

為了評(píng)估混合性能，研究人員將含有綠色熒光染料的水溶液和不含熒光染料的水溶液通過每個(gè)入口分別引入微混合器，兩股入口流在Y形大通道處合并成一股流，然后引入第一混合單元。在不同流速下在微混合器的入口和每個(gè)窗口捕獲熒光顯微鏡圖像。為了進(jìn)行比較，使用沒有微纖維通道的微流控混合器作為對(duì)照。圖2a顯示了對(duì)照和不同MBR的每個(gè)窗口的代表性熒光顯微鏡圖像和相應(yīng)的橫截面強(qiáng)度分布。與對(duì)照不同，隨著所有類型的微混合器中三個(gè)混合單元的通過，熒光強(qiáng)度趨于變成半圓形，表明接近完全混合。微纖維通道直徑較大的微混合器表現(xiàn)出更好的混合性能。

圖2 微型混合器的混合效率及其特點(diǎn)

接著，研究人員準(zhǔn)備了一個(gè)具有薄中間層（厚度約為34 μm）的微混合器，通過避免明亮的熒光背景，使用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)流動(dòng)行為。圖3a顯示了薄型微混合器中含有綠色熒光染料的水相的延時(shí)熒光圖像。從大通道引入的水相在微混合器中沿著纖維微通道分成許多子流。子流在整個(gè)微混合器的連接處反復(fù)分裂和交叉（圖3b ~ 3c）。微纖維通道的彎曲結(jié)構(gòu)可以誘導(dǎo)旋流，從而增強(qiáng)ME。除了多重分流/交叉機(jī)制外，纖維微通道由于其混沌和隨機(jī)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了混合流在微混合器中的循環(huán)利用，從而提高了ME。綜上所述，優(yōu)異的混合性能可歸因于混沌纖維微通道的獨(dú)特幾何形狀和多個(gè)連接處。

圖3 微纖維通道的延時(shí)熒光顯微鏡圖像

微流控生物反應(yīng)器（MBR）由兩個(gè)帶有纖維微通道（混合部分）和一個(gè)長(zhǎng)宏觀通道（反應(yīng)部分）的混合單元組成用來演示連續(xù)的mRNA IVT。有兩個(gè)入口用于引入由IVT成分組成的溶液1和溶液2。溶液1是T7 pol、rNTP和轉(zhuǎn)錄緩沖液的混合物，而溶液2是模板DNA、增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄緩沖液的混合物（圖4a）。如圖4b所示，模板DNA和mRNA在PDMS基底上的吸附量分別為8.54% ± 1.95%和8.81%± 1.20%。相比之下，PFPE基底上吸收了極少量的模板DNA（0.63% ± 0.42%）和mRNA（0.15% ± 0.11%）。吸附量的差異是由于PDMS的固有疏水性和PFPE材料的低表面能造成的。因此，選擇PFPE作為mRNA IVT的MBR材料。

接著，以0.4 mL/h的總流速，每20 min在出口收集合成產(chǎn)物，然后計(jì)算mRNA合成效率。將合成的mRNA量與批量IVT中的合成量進(jìn)行比較。mRNA合成效率隨著時(shí)間的推移而增加，然后達(dá)到接近100%的平臺(tái)（圖4d），表明與批量IVT沒有顯著差異。由于反應(yīng)物溶液的量極少，很難將兩種溶液同時(shí)引入MBR。初始階段的低合成效率歸因于溶液1和2之間的不平衡。如圖4c所示，較高的流速導(dǎo)致較低的ME值。因此，以總流速的0.4 mL/h和1.6 mL/h評(píng)估流速對(duì)mRNA合成效率的影響（圖4e）。MBR中的mRNA合成效率接近100%，而對(duì)照裝置中的mRNA合成效率僅限于74%。這些結(jié)果表明，快速混合在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的mRNA合成效率中起著重要作用。

圖4 PFPE-MBR中的連續(xù)體外轉(zhuǎn)錄特性

為了確認(rèn)完整性，使用Agilent 5200片段分析系統(tǒng)對(duì)本體和MBR中合成的mRNA進(jìn)行了分析。本體和MBR中合成的mRNA的電泳圖像和電泳圖顯示，兩mRNA均由1804個(gè)核苷酸（nt）組成，表明大小相同（圖5a）。為了驗(yàn)證mRNA的性能，在完全培養(yǎng)基中用與Lipofectamine復(fù)合的mRNA轉(zhuǎn)染Nor10細(xì)胞（圖5b）。等量mRNA的轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染后6小時(shí)和24小時(shí)產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)臒晒馑孛副磉_(dá)水平。這些體外實(shí)驗(yàn)表明，在MBR中合成的mRNA表現(xiàn)出與批量合成的mRNA相當(dāng)?shù)男阅堋?duì)于體內(nèi)熒光素酶表達(dá)測(cè)定，將大量合成的熒光素酶mRNA和MBR注射到小鼠耳部皮膚中。與體外轉(zhuǎn)染結(jié)果相似，兩種mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（圖5c）。這些結(jié)果證實(shí)，MBR中合成的mRNA與明確的批量IVT中合成的mRNA具有相同的特性和功效。

圖5 mRNA的完整性測(cè)試和性能評(píng)估

綜上，該研究提出了使用電紡纖維基質(zhì)作為模板的具有微纖維通道的微流控混合器的簡(jiǎn)便制造方法。均勻混合主要取決于引入的流體在整個(gè)微混合器的許多連接處的混沌分裂和交叉。即使混合長(zhǎng)度較短（4 mm），微混合器16在各種流速下也表現(xiàn)出接近0.9的高M(jìn)E值。小型微混合器中存在大量連接點(diǎn)是該微混合器設(shè)計(jì)的一個(gè)關(guān)鍵特征。三個(gè)混合單元的通過導(dǎo)致均勻的流體混合，ME值大于0.95。這種方法的主要特點(diǎn)如下：（1）微混合器制造過程簡(jiǎn)便；（2）不需要外部能量；（3）在短時(shí)間內(nèi)和長(zhǎng)度內(nèi)具有高M(jìn)E值。此外，使用PFPE-MBR和微混合器證明了mRNA的連續(xù)生產(chǎn)具有高產(chǎn)量。PFPE-MBR具有優(yōu)異的混合性能以及對(duì)反應(yīng)物和產(chǎn)物的惰性，可以成為各種化學(xué)和生物反應(yīng)的平臺(tái)。

審核編輯：劉清