微重力下3D組織結(jié)構(gòu)的生物制造及其在人體病理生理研究中的應(yīng)用

近年來，人們對生物工程的興趣日益濃厚，尤其是體內(nèi)類3D功能組織，這促進(jìn)了生物制造過程新方法的建立，并擴(kuò)大了這些獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。太空飛行過程中產(chǎn)生的微重力是一種獨(dú)特的環(huán)境，可能有利于組織工程過程，但不能在地球上完全復(fù)制。此外，在太空中進(jìn)行人類和動物研究的費(fèi)用和實(shí)際挑戰(zhàn)使生物工程微生理系統(tǒng)成為一種有吸引力的研究模式。

基于此，近期，約翰·霍普金斯大學(xué)的Deok-Ho Kim教授和美國布朗大學(xué)的Peter H.U. Lee教授對相關(guān)研究，例如利用真實(shí)和模擬的微重力來改善各種組織類型的生物制造，以及使用微生理系統(tǒng)（如器官/組織芯片和多細(xì)胞類器官）在空間中建立人類疾病模型等進(jìn)行了總結(jié)，并討論了真實(shí)和模擬的微重力平臺及其在組織工程微生理系統(tǒng)中的應(yīng)用，包括：（1）應(yīng)用微重力條件改進(jìn)組織結(jié)構(gòu)的生物制造；（2）利用在微重力條件下制作的組織結(jié)構(gòu)作為地球上人類疾病的模型；（3）利用生物制造的體外模型研究微重力對人體組織的影響。相關(guān)內(nèi)容以“Biomanufacturing of 3D tissue constructs in microgravity and their applications in human pathophysiological studies”為題發(fā)表在Advanced Healthcare Materials期刊上。

真實(shí)微重力（r-μG）可以通過在飛機(jī)或太空飛行器上的自由落體飛行模式來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)飛行的高度，這些平臺可以分為拋物線、亞軌道和軌道（圖1）。飛機(jī)上的拋物飛行通常在大約10公里的高度進(jìn)行（圖1A）。在拋物線飛行期間，一架飛機(jī)在大約20 ~ 40秒的自由落體r-μG階段和1.8 G的超重力上拉階段之間交替飛行20 ~ 60條拋物線（圖1B）。與拋物線飛行不同，亞軌道飛行（圖1C）有一個更長的軌道，可以達(dá)到海平面以上100公里，達(dá)到空間的技術(shù)邊界。國際空間站（ISS，圖1D、E）于1998年發(fā)射后，作為μG研究環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，是目前使用最密集的r-μG研究平臺。

圖1 用于生物研究的真實(shí)微重力平臺

旋轉(zhuǎn)壁容器（RWV），或旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）由一個可以裝滿培養(yǎng)基的圓柱體組成，并以恒定的速度圍繞其中心軸不斷旋轉(zhuǎn)，以及一個氧氣補(bǔ)充單元，或者在培養(yǎng)柱的中心作為一個較小的靜態(tài)鋼瓶，或者在其底部作為一個多孔板（圖2A）。

RWV通過向上的水動力牽引，迫使圓柱體中的粒子進(jìn)行連續(xù)的圓周運(yùn)動，從而創(chuàng)造了μG條件，這反過來在理論上與旋轉(zhuǎn)過程中產(chǎn)生的向下重力相抵消（圖2B）。恒定器是一種裝置，它使樣品圍繞單個或多個軸連續(xù)旋轉(zhuǎn)，以抵消向下的重力對生物系統(tǒng)的影響（圖2C）。

在旋轉(zhuǎn)過程中，樣品向下的重力可以在數(shù)學(xué)上平均為零，在旋轉(zhuǎn)軸周圍產(chǎn)生一個類似μG的理論環(huán)境（圖2D）。與2D傾斜器使樣品保持在圓柱形表面上旋轉(zhuǎn)不同，3D傾斜器使樣品在虛擬球形平面上旋轉(zhuǎn)（圖2E）。為了獲得更好的μG模擬結(jié)果，研究人員通過隨機(jī)化兩個軸的轉(zhuǎn)速和方向，進(jìn)一步優(yōu)化了3D傾斜器（圖2F）。

圖2 工程組織模擬微重力的方法

生物制造的目標(biāo)是生成與生理相關(guān)的功能性3D組織結(jié)構(gòu)，如微組織（即球狀體）和具有典型的細(xì)胞和大分子組織的類器官。3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)允許相同或不同類型的細(xì)胞之間的多維附著和相互作用，與2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，這更好地模擬了體內(nèi)環(huán)境。因此，3D組織結(jié)構(gòu)被更多地用于臨床應(yīng)用，包括體外疾病建模和植入。在模擬微重力（s-μG）環(huán)境中，細(xì)胞可以懸浮在培養(yǎng)基中，形成具有改進(jìn)的生理特性的多細(xì)胞球狀體，包括更大的尺寸、更小的缺氧中心、微結(jié)構(gòu)，以及有或沒有微載體作為支架的組織特異性標(biāo)記物的表達(dá)（圖3）。例如，RWV（圖3A左）制作的人骨類器官比標(biāo)準(zhǔn)重力（圖3A右）表現(xiàn)出更高的堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)。

在RWV中形成的人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)類器官顯示了神經(jīng)標(biāo)記物MAP2的表達(dá)（圖3B）。在RWV中形成的人肝類器官具有多層結(jié)構(gòu)（圖3C）。在r-μG條件下形成的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）來源的心臟類器官比在標(biāo)準(zhǔn)重力條件下形成的球狀體顯示出更大的直徑（圖3D）。在RWV中培養(yǎng)的類器官中可以觀察到滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合（圖3E）。在RWV中形成的人腸上皮類器官顯示了上皮特異性抗原（ESA）的表達(dá)（圖3F）。

圖3 在模擬和真實(shí)的微重力環(huán)境中制備的組織類器官

如上所述，在μG環(huán)境中形成的特定組織類型的3D多細(xì)胞球狀體表現(xiàn)出包括仿生性、復(fù)雜的微觀結(jié)構(gòu)和更小的缺氧面積等生理特性。因此，它們是體外疾病建模和細(xì)菌感染及細(xì)胞-細(xì)胞相互作用研究的理想選擇（圖4）。此外，μG誘導(dǎo)的心臟功能障礙、骨丟失和骨骼肌萎縮已經(jīng)在μG平臺上使用體外組織模型進(jìn)行了研究。相關(guān)研究利用在μG平臺上制作的組織模型，研究了甲狀腺、肺和腸等器官的非微重力相關(guān)病理。

圖4 利用微重力平臺作為工具研究人體的病理狀況

目前，已有研究人員利用A549肺上皮細(xì)胞與微珠共培養(yǎng)的類器官在旋轉(zhuǎn)壁血管（RWV）中形成了結(jié)實(shí)的3D聚集（圖5A）。感染表達(dá)GFP的銅綠假單胞菌后，球狀體顯示綠色感染區(qū)域（圖5B）。HCT-8細(xì)胞系的類器官在RWV中培養(yǎng)后顯示出柱狀上皮樣結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出細(xì)小隱孢子蟲局部感染（黑色箭頭）（圖5C、D）。在RWV中制備的肝腫瘤類器官顯示在2周時HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞（紅色）的增殖（圖5E）。在用激動劑BIO或拮抗劑XAV939調(diào)節(jié)WNT通路后，HCT-116細(xì)胞的增殖發(fā)生了明顯的變化，說明WNT通路影響HCT-116的增殖（圖5F）。

圖5 在s-μG環(huán)境中制備的組織類器官的代表性病理研究應(yīng)用

此外，更多組織類型的微生理系統(tǒng)正在被應(yīng)用于許多正在進(jìn)行的空間生物學(xué)項(xiàng)目中（圖6）。這些被資助的項(xiàng)目包括不同組織類型的應(yīng)用，如hiPSC衍生的工程心臟組織、腎臟近端和遠(yuǎn)端小管組織芯片、人類骨骼肌模型和人類血腦屏障芯片等。

圖6 已在ISS美國國家實(shí)驗(yàn)室飛行的代表性組織芯片

綜上所述，該論文總結(jié)了微重力用于有、無支架的各種細(xì)胞類型的3D構(gòu)建。除了可以產(chǎn)生模擬微重力和不同支架類型的生物反應(yīng)器外，這些細(xì)胞系本身也可以被認(rèn)為是選擇其特定生成潛力的工具。干細(xì)胞由于其多能性，通常最有利于3D結(jié)構(gòu)的形成。通過在微重力模擬平臺上共培養(yǎng)多種細(xì)胞類型，也可以形成更大的仿生結(jié)構(gòu)，為個性化醫(yī)學(xué)和病理研究提供更精確的模型。雖然微重力已被證明可以增強(qiáng)類器官的形成，但抑制球狀體形成的矛盾結(jié)果也存在。這可能歸因于使用了不同的方案，包括支架的大小和培養(yǎng)時間。然而，某些組織類型的發(fā)展，特別是肌肉組織，可能會因微重力改變的機(jī)械感應(yīng)途徑而變得復(fù)雜，這使得這些平臺可能在研究這種病理機(jī)制方面更加有用?？偟膩碚f，空間醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究加強(qiáng)了對推進(jìn)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的努力。隨著人類繼續(xù)冒險(xiǎn)進(jìn)入“最終前沿”，研究人員也必須繼續(xù)探索生物醫(yī)學(xué)科學(xué)和生物工程的新前沿。

審核編輯：劉清