濱松單相機(jī)雙色同步成像解決方案

??使用靈活之隨意更換濾光片

??W-View GEMINI允許使用者自行更換其中的濾光片以靈活適應(yīng)于各種顏色/波長(zhǎng)之間的分光需求。其中的濾光片尺寸為顯微鏡中常用的標(biāo)準(zhǔn)尺寸，最大限度地方便研究者對(duì)于濾光片的挑選使用。

????使用靈活之W-View讀出模式

??采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號(hào)成像到一臺(tái)相機(jī)的一個(gè)感光芯片上很好地解決了同步成像的時(shí)間問(wèn)題，但對(duì)于絕大多數(shù)的相機(jī)，整個(gè)感光芯片只能設(shè)置一個(gè)曝光時(shí)間，當(dāng)兩個(gè)顏色的信號(hào)強(qiáng)度相差較大時(shí)將很難同時(shí)將兩個(gè)顏色的成像信噪比保證在最佳狀態(tài)。

??而濱松Flash 4.0系列sCMOS相機(jī)則可以分別調(diào)整同一芯片上下兩半的曝光時(shí)間，稱為W-View讀出模式。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0系列sCMOS相機(jī)的時(shí)候，我們可以非常靈活地調(diào)整兩個(gè)顏色信號(hào)的相對(duì)亮度，得到更加能夠突出所需信號(hào)和結(jié)構(gòu)的圖片。在兩個(gè)顏色通道的信號(hào)差別非常大的時(shí)候，F(xiàn)lash 4.0系列sCMOS相機(jī) + W-View GEMINI這種靈活的曝光時(shí)間設(shè)置就可以針對(duì)不同的波長(zhǎng)設(shè)置不同的曝光時(shí)間，同時(shí)保證兩個(gè)波長(zhǎng)信號(hào)的信噪比。

??應(yīng)用之雙色同步高速成像

??濱松W-View GEMINI雙色分光器可以將顯微鏡下同一個(gè)樣品的信號(hào)按照波長(zhǎng)分別成像到同一臺(tái)相機(jī)的兩邊，配合高速高靈敏度的Flash 4.0系列sCMOS相機(jī)就可以做到非常高速的雙色同步成像。下面這個(gè)例子中( Nature Methods (2014) 11:919-922 )，作者在300-500幀/秒單層光片(lightsheet)成像的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)斑馬魚心臟的3D高速光片雙色成像。濱松高速高靈敏度的sCMOS相機(jī)Flash 4.0和雙色分光器W-View GEMINI 被用于這一套"high-speed SPIM"系統(tǒng)中。對(duì)于高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機(jī)，作者在文章中專門提到： "… Our data demonstrate that the high acquisition speed of SPIM with modern sCMOS cameras (400 fps for 512 × 512 pixels) is key for optimal 3D reconstructions of the beating heart."

??下面這個(gè)應(yīng)用實(shí)例則是希望通過(guò)Di-4-ANEPPS這個(gè)染料對(duì)iPS心肌細(xì)胞的膜動(dòng)作電位進(jìn)行成像。Di-4-ANEPPS這種熒光染料通過(guò)藍(lán)光(~48 8nm)激發(fā)，其發(fā)射波長(zhǎng)卻會(huì)根據(jù)膜電位而有所變化，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞不同區(qū)域內(nèi)525 nm/630 nm的比值就可以得到此區(qū)域內(nèi)膜電位的變化。這種成像方法相相對(duì)膜片鉗等電生理方法而言，可以得到細(xì)胞任意位置的膜電位變化，空間分辨率更高。而W-View GEMINI雙色分光附件以及高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機(jī)的應(yīng)用也保證了其極高的時(shí)間分辨率(每秒100個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn))，使得我們可以對(duì)細(xì)胞任意位置的動(dòng)作電位進(jìn)行時(shí)間空間都非常精確的測(cè)量。

????應(yīng)用之明場(chǎng)-熒光同步成像

??在顯微成像中，有時(shí)會(huì)希望能夠?qū)晒夂兔鲌?chǎng)進(jìn)行完全同步的成像。例如在下面所示的例子中，斑馬魚尾部血管中的部分血細(xì)胞被標(biāo)記了綠色的熒光。為了區(qū)分清楚同時(shí)處于高速運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的被標(biāo)記細(xì)胞和普通細(xì)胞，以及看清楚其具體的行為，我們不僅需要高速采像，而且需要完全同步地拍攝到樣品熒光和明場(chǎng)的圖像;否則對(duì)于這樣高速運(yùn)動(dòng)的樣品，先拍一張明場(chǎng)再拍一張熒光就很難做到細(xì)胞的一一對(duì)應(yīng)。而為了達(dá)到這些要求，我們采用紅光進(jìn)行明場(chǎng)的拍攝，這樣W-View GEMINI雙色分光器就可以將紅色的明場(chǎng)信號(hào)及綠色的熒光信號(hào)分光并成像到相機(jī)芯片的兩邊(參見(jiàn)下右的光路示意圖)，實(shí)現(xiàn)完全同步地?zé)晒夂兔鲌?chǎng)成像。實(shí)驗(yàn)中濱松Flash 4.0 LT sCMOS相機(jī)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)400幀/秒的高速拍攝，而且其高靈敏度保證了對(duì)應(yīng)的2.5 ms曝光時(shí)間下熒光圖片的清晰( "詳細(xì)解說(shuō)視頻" )

??而在下面這個(gè)例子中，研究者同步拍攝監(jiān)測(cè)了心肌細(xì)胞波動(dòng)時(shí)的鈣離子濃度變化以及細(xì)胞收縮的情況。藍(lán)光激發(fā)發(fā)綠色熒光的Fluo-8被用于鈣離子濃度的監(jiān)測(cè)，而明場(chǎng)的相差(phase contrast)成像則是采用了600-680 nm的紅光。通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞中鈣離子濃度和相差圖像的分析，可以看出鈣離子的濃度上升是稍稍領(lǐng)先于心肌細(xì)胞的收縮的。

??參數(shù)

審核編輯 黃宇