利用熒光成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)糖尿病發(fā)展和治療進(jìn)程

糖尿?。―M）通常有胰島素的合成及釋放異常的表現(xiàn)。研究表明，2014年18歲以上的糖尿病患者人數(shù)（4.22億）是1980年（1.08億）的四倍。糖尿病的常見癥狀包括多尿、疲勞和情緒障礙等，肝臟和腎臟是其內(nèi)部損害的主要部位，如果不能及時(shí)診斷則可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。在目前糖尿病的診斷指標(biāo)中，一直被廣泛應(yīng)用的是血糖和糖化白蛋白等，但其水平變化主要集中在糖尿病發(fā)生后的晚期過程，且不能實(shí)時(shí)體現(xiàn)糖尿病發(fā)展的進(jìn)程。

雖然熒光探針具備操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于糖尿病發(fā)展和治療過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)研究較少。目前研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸（Cys）水平與糖尿病病理過程具有潛在的相關(guān)性，生物體內(nèi)血糖的升高伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，但其具體的生物學(xué)過程尚未被闡述清晰。因此，迫切需要開發(fā)Cys熒光探針用于糖尿病的診斷和治療，為糖尿病的臨床研究提供重要信息。

為解決以上問題，江南大學(xué)附屬兒童醫(yī)院王凱、胡志剛和南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊雨順、蘇州大學(xué)藥學(xué)院姚坤、南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院秦亞娟等合作在RedoxBiology期刊上發(fā)表了題為“Discovery of the cysteine dynamics during the development and treatment of diabetic process by fluorescent imaging”的研究，該研究開發(fā)了一種新型熒光探針RhoDCM，用于監(jiān)測(cè)糖尿病診療過程中Cys的動(dòng)態(tài)變化。基于不同糖尿病模型小鼠的活體及組織熒光成像表明，RhoDCM可通過監(jiān)測(cè)Cys的動(dòng)態(tài)變化來表征不同誘導(dǎo)劑導(dǎo)致的糖尿病病理過程，并對(duì)藥物治療效果進(jìn)行評(píng)估。

該研究開發(fā)了一種監(jiān)測(cè)Cys動(dòng)力學(xué)的熒光探針RhoDCM，其具有穿透深度、成像能力優(yōu)良等性質(zhì)，并成功應(yīng)用于糖尿病的發(fā)展和治療過程。RhoDCM對(duì)Cys的檢測(cè)具有很高的選擇性和抗干擾性，可區(qū)分Cys、谷胱甘肽（GSH）和同型半胱氨酸（Hcy）。與已報(bào)道的Cys探針相比，RhoDCM線性范圍寬（0 ~ 100 μM），檢測(cè)限低（0.23 μM），可滿足Cys的生理及病理檢測(cè)范圍。由圖1可知，RhoDCM在480 nm處有較小的紫外吸收峰，Cys的加入使其吸收峰明顯增強(qiáng)。此外，在480 nm的外源激發(fā)下，RhoDCM與Cys反應(yīng)后在570 nm處具有顯著的熒光發(fā)射峰。在pH 6.0 ~ 8.0和溫度30℃ ~ 40℃范圍內(nèi)，RhoDCM對(duì)Cys的熒光響應(yīng)時(shí)間短（小于5 min），并且穩(wěn)定性好（大于60 min）。因此，RhoDCM對(duì)Cys在生理?xiàng)l件下具有較好的檢測(cè)性能。

圖1RhoDCM在體外對(duì)Cys的檢測(cè)性能研究

因?yàn)镽hoDCM與Cys在體外測(cè)試中具有較高的選擇性，并能夠迅速完成熒光響應(yīng)，故RhoDCM在細(xì)胞成像中具有較大的應(yīng)用潛力。首先在HeLa細(xì)胞中對(duì)RhoDCM進(jìn)行毒性檢測(cè)得知其毒性較小。然后利用RhoDCM可對(duì)細(xì)胞外源和內(nèi)源的Cys水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于葡萄糖濃度的增加會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的Cys含量，因此RhoDCM可以通過熒光信號(hào)的變化來監(jiān)測(cè)胞內(nèi)的葡萄糖水平（圖2）。

圖2 RhoDCM用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞模型中Cys的動(dòng)態(tài)變化

此外，建立糖尿病小鼠模型和藥物治療模型，即設(shè)正常對(duì)照組、模型組（鏈脲佐菌素或四氧嘧啶誘導(dǎo)）和治療組（鏈脲佐菌素誘導(dǎo)后給予治療藥物維達(dá)格列汀、達(dá)伐他汀、二甲雙胍），利用RhoDCM成像監(jiān)測(cè)并結(jié)合口服糖耐量試驗(yàn)和與肝臟相關(guān)的重要指標(biāo)來驗(yàn)證模型構(gòu)建的準(zhǔn)確性，并評(píng)估藥物治療效果。活體成像結(jié)果表明，RhoDCM可以通過監(jiān)測(cè)體內(nèi)Cys的動(dòng)態(tài)變化來表征糖尿病過程中的發(fā)展和治療狀況（圖3）。

圖3 RhoDCM在對(duì)照組、糖尿病組、治療組小鼠及肝臟的熒光成像

在此基礎(chǔ)上，該研究進(jìn)一步對(duì)不同模型及治療組中的肝組織進(jìn)行深入探討，通過組織熒光和染色結(jié)果證實(shí)，RhoDCM可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同刺激劑導(dǎo)致的糖尿病病理過程，并對(duì)不同治療藥物進(jìn)行評(píng)估，綜合評(píng)價(jià)各治療方案的有效性（圖4）。

圖4 RhoDCM對(duì)不同模型及治療組小鼠肝組織切片的熒光成像及染色

綜上所述，該研究開發(fā)了一種新型熒光探針RhoDCM，用于監(jiān)測(cè)糖尿病小鼠模型中Cys的動(dòng)態(tài)變化。RhoDCM對(duì)Cys的響應(yīng)表明其具有高靈敏度、高選擇性、反應(yīng)速度快、在不同的pH和溫度條件下穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。RhoDCM可以通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞外源性和內(nèi)源性的Cys水平，進(jìn)一步衡量胞內(nèi)血糖水平。此外，該研究建立的糖尿病小鼠模型（鏈脲佐菌素或四氧嘧啶誘導(dǎo)）通過口服糖耐量試驗(yàn)和血清指標(biāo)進(jìn)行檢查后，利用RhoDCM進(jìn)行糖尿病發(fā)展進(jìn)程中Cys的實(shí)時(shí)成像監(jiān)測(cè)，并對(duì)維達(dá)格列汀、達(dá)伐他汀、二甲雙胍藥物的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)?；诨铙w和組織熒光成像表明，RhoDCM可以通過監(jiān)測(cè)Cys的動(dòng)態(tài)變化來表征糖尿病進(jìn)程中的發(fā)展和治療狀況。雖然該研究無法完全闡明糖尿病發(fā)展進(jìn)程中Cys具體的作用機(jī)制，但RhoDCM對(duì)推斷糖尿病進(jìn)程階段和評(píng)估治療方案的有效性是有益的，這為今后的糖尿病相關(guān)臨床研究提供重要信息。

審核編輯：劉清