雙光子顯微成像用飛秒激光器

雙光子激發(fā)熒光（TPEF）顯微鏡，也稱為雙光子顯微鏡，是對活體組織深層三維成像的首選方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢，它使用了更長的激發(fā)波長（通常是近紅外波段），因而其帶來的散射比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見波長更少。更長的波長同時也減少了來自散射光的背景照明，并增加了在更高深度處的對比度。目前，用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內大腦圖像。

在熒光顯微鏡中，當兩個獨立的光子被一種介質同時吸收時，就會發(fā)生雙光子激發(fā)。這需要兩個合適能量的光子在這樣的介質上時間和空間上同時重合；通常來說這不需要非常大的激發(fā)光子通量，當然光子通量越大， 雙光子同時被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中，更高的光子通量會帶來更高的效率，從而帶來圖像質量和分辨率的提升。

在TPEF顯微鏡中，雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過寬波段可調諧的鈦寶石飛秒激光器實現(xiàn)的，激光器典型規(guī)格脈寬為100fs，重復頻率約為80MHz，這可以給雙光子顯微鏡帶來非常高的峰值功率和大光子通量。然而，激光器較高的平均功率（在1~4瓦范圍內）會由于激發(fā)波長的線性吸收引起的與介質的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應在體內成像中尤其重要，因為溫度超過40oC會導致不可逆的損傷。因此，傳統(tǒng)的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實際應用于TPEF顯微鏡，峰值功率也會相應地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷，同時縮短脈沖持續(xù)時間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質上的時間間隔，同時提高了介質被吸收的概率。

近日，西班牙FYLA公司首次利用先進超連續(xù)譜全光纖激光器技術得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器，命名型號“SCH”。與傳統(tǒng)的100fs激光器相比，SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過傳統(tǒng)飛秒激光器7倍的光子通量。

圖1：FCH 寬光譜光纖飛秒激光器，波長范圍950-115nm，脈沖寬度15fs, 峰值功率>200kW

圖2：藍色線：SCH 飛秒激光器光譜曲線；橙色線：1um波段百秒激光器光譜曲線；灰色線：紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜

但是，巨幅提高每個時間和面積上可用光子數(shù)量對圖像的真正影響是什么呢？

一、更高的激發(fā)效率，更高的圖像亮度

理論上，在雙光子顯微鏡中，圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關，而激發(fā)效率完全依賴于光子通量和熒光團的二階非線性激發(fā)截面(GM) 。作為一個例子，我們可以嘗試計算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬（如SCH飛秒激光器）和1050nm中波長照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比，15fs激光器具有更寬的帶寬（達200nm），可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP，與100fs激光器的11nm相比，這是一個更寬的光譜區(qū)域。

圖3：藍色曲線：以1050nm為中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率；橙色曲線：以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截面(GM)

考慮到各波長的峰值功率和激發(fā)截面，可以計算出mRFP的激發(fā)效率。結果表明，與傳統(tǒng)100fs激光器相比較，SCH飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%。

圖4：藍色曲線：SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率；橙色曲線：100fs光纖飛秒激光器的峰值功率；黑色曲線：mRFP的二階非線性激勵截面(GM)

圖5：小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡圖像，用SYTOX Green標記細胞核（黃色）和Alexa Fluor 568煥鈦標記肌動蛋白絲（藍色）

二、多色同時激發(fā)

想象一下，同時成像多個波段范圍的熒光團，而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長的激光器。在雙光子顯微鏡中，使用傳統(tǒng)的100fs激發(fā)激光器，這通常是一個復雜的，有時甚至是不可能完成的任務。

傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器（例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器）的光譜寬度通常在10~20nm范圍內，它們只能同時激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內的熒光團。因此，若想用單臺激光器去同時激發(fā)更多種類的熒光團就需要帶寬更寬，脈沖更短的激光器。

SCH寬光譜飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時以1050nm為中心波長提供200nm的帶寬，在這個帶寬范圍內 （橫跨900到1200nm）的所有綠色和紅色的熒光團都可以同時被這種激光器激發(fā)。這對于雙光子顯微鏡來說，同時對多個熒光團成像成為一個可行的，實用的和簡單的替代。

圖5：常見熒光探針激發(fā)波長

圖6：小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡圖像

用Sytox Green標記細胞核（洋紅色），F(xiàn)ITC濾波器；用Alexa Fluor 568 Phaloidin標記肌動蛋白絲（綠色），TRITC過濾器。

兩種熒光標記物同時被SCH激光器激發(fā)，用尼康的熒光濾片組過濾熒光。

Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain。

綜上所述，F(xiàn)YLA公司推出的新型、緊湊而強大的SCH全光纖飛秒激光器激光器，提供15fs的脈沖持續(xù)時間和一流的高峰值功率（>200kW），為體內樣本的低光損傷激發(fā)提供了強大的工具。結合全光纖激光器的緊湊性和堅固性性，SCH飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。

現(xiàn)在，F(xiàn)YLA公司推出SCH飛秒激光器的免費測試服務，包括運輸和安裝，無需承諾購買，此外對已購買的客戶提供全面免費2年質保優(yōu)惠政策，如果您對SCH激光器感興趣并有意測試使用，請隨時聯(lián)系上海昊量光電設備有限公司。

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