WB，IP，IHC，IF，ChIP，F(xiàn)C抗體能通用嗎？

疑問：

查詢抗體的時候，發(fā)現(xiàn)在抗體應(yīng)用欄中，有的抗體適用于WB、IP、IHC、IF、F、CHIP等所有實(shí)驗(yàn)，而有的抗體適用于WB、IHC、IF、F，不適用于IP和CHIP?科研人員都傾向使用一種抗體將預(yù)計(jì)的實(shí)驗(yàn)做完，避免去尋找其它抗體，所以首選能通用抗體。

而上一篇《WB，IP，IHC，IF，ChIP，F(xiàn)C抗體的區(qū)別?》提出WB，IP，IHC，IF，ChIP，F(xiàn)C抗體為什么不能通用?其中WB抗體是識別線性抗原表位的抗體，而其它方法學(xué)需要針對識別構(gòu)象抗原表位的抗體。這就導(dǎo)致WB抗體不適用其他方法學(xué)。

疑問出現(xiàn)：一會說首選能通用的抗體，一會又說抗體為什么不能通用。這究竟是怎么回事?

為了解釋上面提到的疑問，首先需要了解決定抗原特異性的抗原表位;同時了解抗體的兩種分類：單克隆抗體和多克隆抗體。

抗原特性：

抗原的特異性是免疫學(xué)檢測、診斷及防治的分子基礎(chǔ)和理論依據(jù)，而決定抗原特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就是存在于抗原分子中的抗原表位(epitope)。根據(jù)抗原表位的空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可將其分為順序表位(sequential epitope)和構(gòu)象表位(conformational epitope)。順序表位由肽鏈上一段序列相連續(xù)的線性氨基酸殘基所構(gòu)成，又稱線性表位。順序表位存在于抗原分子的任意部位。構(gòu)象表位由多肽或多糖鏈上空間位置相鄰，而序列上不相連續(xù)的氨基酸或多糖殘基所構(gòu)成。

抗體分類：

單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。

多克隆抗體(polyclonal antibody， pAb)：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機(jī)體多個B細(xì)胞克隆，相應(yīng)地就產(chǎn)生針對多種抗原表位的多種單克隆抗體，所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種單克隆抗體的混合物，即多克隆抗體。

如果制備抗體的抗原，既含有線性抗原表位，又含有構(gòu)象抗原表位，并且抗體識別的抗原表位和該蛋白質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的部位不一致的情況下，同時以多克隆形式呈現(xiàn)的抗體，那么此抗體就有可能成為通用抗體(具體還得以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為準(zhǔn)，因?yàn)榭贵w研發(fā)出來之后都要經(jīng)過WB，IP，IF，IHC等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能最終確認(rèn)其適用范圍)。

另外，如果抗體識別的抗原表位和該蛋白質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的部位一致的情況下，則會導(dǎo)致Co-IP，CHIP實(shí)驗(yàn)的失敗。這也就出現(xiàn)前面疑問提到：有的抗體適用于WB、IHC、IF、F，不適用于IP和CHIP。

如果制備的抗體的抗原只含有線性抗原表位，那此抗體通常情況下只適用于WB實(shí)驗(yàn)。因?yàn)槠渌椒▽W(xué)的目標(biāo)蛋白一般無需經(jīng)過變性處理，需要用抗體去識別天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，目標(biāo)蛋白可能既含有線性抗原表位，又含有構(gòu)象抗原表位，如果線性抗原表位暴露在蛋白質(zhì)表面，沒有包裹在蛋白內(nèi)部而無法識別，那此時的WB抗體也有可能適用其他方法學(xué)。

有的實(shí)驗(yàn)為了特異性，選擇單克隆抗體，那此時抗體的適用范圍就會變窄。但也有特殊情況，例如圖一中Rb(4H1)Mouse mAb(9309)，此抗體為單克隆抗體，但是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其居然適用WB、IP、IHC、IF、F、CHIP等所有實(shí)驗(yàn)。推測此抗體的抗原只含有線性抗原表位，并且抗原表位暴露在蛋白質(zhì)表面，沒有包裹在蛋白內(nèi)部而無法識別，那這個抗體就有可能適用上述提到所有方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，在適用范圍驗(yàn)證過程中也恰好證明如此。

綜上，一個抗體的適用范圍是由抗原決定簇決定的，包含線性抗原表位或者構(gòu)象抗原表位;抗體識別抗原表位是否影響該蛋白與目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合;同時又取決于抗體是單克隆抗體或者多克隆抗體。

單克隆特異性好，應(yīng)用范圍有限;多克隆抗體猶如多種單克隆抗體的混合物，它們有的特異性高，有的特異性低，總體特異性符合正態(tài)分布曲線的形式，適用范圍更廣。但是具體到使用單抗還是多抗，則需要具體問題具體分析。比如檢測的蛋白濃度低，用多抗檢測到的可能性會比單抗高。又或者待檢測蛋白被分割成兩段，那就需要針對識別兩段抗原表位的多抗。

題外：

關(guān)于假陽性

根據(jù)抗體最核心的表位結(jié)合區(qū)域—互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity Determining Region，CDR)的結(jié)構(gòu)，抗體通?？梢跃o密結(jié)合的抗原表面區(qū)域或表位面積很小，對于變性的肽段約在4-8個Aa以內(nèi)，以及5-7個單糖的糖鏈或6-8個核苷酸的核酸。通過肽段BLAST可以得知，小肽段序列完全相同的情況將在很多不同蛋白上發(fā)生。這意味著單抗識別的這個表位可能并不僅僅屬于靶標(biāo)蛋白本身，也即意味著，即使利用純化抗原蛋白進(jìn)行了特異性篩選的單克隆抗體，當(dāng)用其檢測復(fù)雜樣本時，也將面臨交叉反應(yīng)或假陽性問題。

靈敏度

特異性決定了假陽性結(jié)果的多少，敏感性決定了檢出率的高低。在復(fù)雜樣本中，由于多克隆抗體識別抗原的多個表位，可以在一個抗原分子上結(jié)合更多的抗體分子，也可以在當(dāng)部分抗原表位受到一定程度的遮蓋或破壞時，仍有抗體結(jié)合在未受影響的表位上。這種情況常發(fā)生在如石蠟包埋的免疫組化(IHC-P)等實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)樣本經(jīng)甲醛交聯(lián)固定后，即使經(jīng)過抗原修復(fù)，抗原表位也不可避免地受到了影響，此時單克隆抗體由于只識別一個表位，結(jié)合能力可能大大降低甚至呈現(xiàn)陰性結(jié)果，而只要不是所有表位都受到了破壞，多抗仍可以獲得該靶點(diǎn)的陽性結(jié)果。同樣的，對于樣本中一些表達(dá)豐度極低的蛋白，由于多表位結(jié)合更多抗體分子，檢測信號就將被放大。因此，使用多抗具有靈敏度和檢出率上的優(yōu)勢。