?基于微流控的原位擴(kuò)增助力核酸定量更快、更準(zhǔn)、更細(xì)致

熒光定量PCR（qPCR）是目前應(yīng)用最廣泛的定量PCR技術(shù)，然而在接近單分子的核酸濃度下，qPCR的無法實現(xiàn)絕對定量，而更先進(jìn)的數(shù)字PCR（dPCR）手段又存在成本高、耗時長、只能檢測低濃度樣本等限制。本文通過在硅基微流控芯片上進(jìn)行PCR反應(yīng)，討論了單分子的“原位擴(kuò)增”現(xiàn)象的科學(xué)性和價值，利用原位擴(kuò)增（在芯片上分子擴(kuò)散局域化）現(xiàn)象實現(xiàn)了排除非特異性擴(kuò)增、模板分辨和高靈敏度核酸檢測等應(yīng)用。研究綜合了qPCR和dPCR兩者之長處，完成了ct值和絕對濃度之間的關(guān)聯(lián)，達(dá)到了從單分子等級到高濃度模板的超大濃度范圍分子檢測，對于快速精確定量未知濃度的核酸樣本提供了新的方法。

該團(tuán)隊創(chuàng)新地使用了硅基微流控進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，利用高效帕爾貼技術(shù)、硅片隔熱設(shè)計和硅片的快速導(dǎo)熱特性，使得通常需要1-2小時的PCR反應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)完成（圖1）。有趣的是，在模板濃度足夠低的情況下，微流控芯片內(nèi)的核酸擴(kuò)增并不均勻：部分流道區(qū)域有擴(kuò)增現(xiàn)象，而有的區(qū)域完全沒有擴(kuò)增。團(tuán)隊將這種現(xiàn)象命名為“on-site PCR（osPCR），即原位擴(kuò)增”現(xiàn)象（圖2）。

圖1 硅基微流控PCR系統(tǒng)（a）微流控芯片（b）加熱紅外圖（c）加熱熱學(xué)仿真（d）不同濃度模板擴(kuò)增結(jié)果，每張圖右上角為陰性對照。

圖2 原位擴(kuò)增現(xiàn)象分析（a）將不均勻流道拆分示意圖（b）每個拆分區(qū)域的熒光擴(kuò)增信號（c）每個拆分區(qū)域的ct值，灰色代表沒有ct。

團(tuán)隊對于osPCR現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究，顯示“原位擴(kuò)增”的點位來自于單個模板分子。團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，原位擴(kuò)增的點位數(shù)量和實際模板濃度正相關(guān)。對于同一芯片上，每一個擴(kuò)增點位的ct基本一致，顯示其初始模板量一致。研究團(tuán)隊假設(shè)大多數(shù)點位只有一個模板分子而計算出了相對應(yīng)的模板濃度，該模板濃度與數(shù)字PCR得到的模板濃度吻合，證明了原位擴(kuò)增現(xiàn)象可以像數(shù)字PCR一樣進(jìn)行核酸的絕對定量（圖3）。

圖3 原位擴(kuò)增來自單分子擴(kuò)增（a-c）對于單個擴(kuò)增點位的代表性照片（a）、擴(kuò)增曲線（b）和ct分布（c） （d-f）對于均勻擴(kuò)增流道的代表性照片（d）、擴(kuò)增曲線（e）和ct分布（f）（g）原位擴(kuò)增手段測試的模板濃度和實際濃度對比 （h）原位擴(kuò)增手段測試的模板濃度和數(shù)字PCR測試濃度對比。

該研究團(tuán)隊利用原位擴(kuò)增現(xiàn)象首次實現(xiàn)了區(qū)分不同模板分子。團(tuán)隊混合了兩種不同長度的模板同時擴(kuò)增，原位擴(kuò)增系統(tǒng)精準(zhǔn)分辨出了不同的模板，并可以對各模板分別定量，甚至確認(rèn)兩種模板的濃度比例（圖4）。利用這種對不同模板分子的區(qū)分能力，團(tuán)隊展示了在低模板濃度時對非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物（如引物二聚體）的剔除。傳統(tǒng)qPCR在低模板濃度時容易出現(xiàn)由于副產(chǎn)物導(dǎo)致的ct值變化，而微流控系統(tǒng)可以剔除副產(chǎn)物信號，在有引物二聚體出現(xiàn)的時候，依然可以得到準(zhǔn)確的ct值（圖5）。

圖4 利用原位擴(kuò)增分辨模板（a）擴(kuò)增圖片（b）熔解圖片（c）各點位擴(kuò)增曲線圖（d）各點位熔解曲線原始圖和（e）各點位熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖。

圖5 利用原位擴(kuò)增去除副產(chǎn)物精確定量（a）不同濃度樣本傳統(tǒng)qPCR擴(kuò)增曲線（b）不同濃度樣本原位PCR不剔除副產(chǎn)物擴(kuò)增曲線（c）不同濃度樣本原位PCR剔除副產(chǎn)物擴(kuò)增曲線（d-e）a-c的ct線型圖。

研究團(tuán)隊將該系統(tǒng)應(yīng)用于新冠臨床樣本檢測中，并針對性地開發(fā)了可以大幅度提升檢測靈敏度的滑窗算法。在新冠檢測中，微流控系統(tǒng)成功地檢出了所有傳統(tǒng)qPCR檢出的樣本（圖6）。更重要的是，在兩個傳統(tǒng)qPCR檢測結(jié)果模糊的樣本上，原位擴(kuò)增系統(tǒng)都確認(rèn)了樣本陽性，與臨床結(jié)果一致（表1）。因此，原位擴(kuò)增系統(tǒng)有望在核酸檢測中作為傳統(tǒng)qPCR的擴(kuò)展。

圖6 利用原為擴(kuò)增進(jìn)行臨床（a）PCR前照片（b）PCR后照片。紅色區(qū)域顯示滑窗算法關(guān)注位置。（c）使用傳統(tǒng)算法的擴(kuò)增曲線和（d）使用滑窗算法的擴(kuò)增曲線。

表1 傳統(tǒng)qPCR和原位擴(kuò)增系統(tǒng)檢測效果對比

本文第一作者丁睿驊博士介紹道：“我們的技術(shù)將qPCR和dPCR進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，將ct值對應(yīng)的相對濃度和絕對模板數(shù)量進(jìn)行了聯(lián)系。通過微流控的設(shè)計，我們不使用微孔或液滴手段也可以分離模板，達(dá)到數(shù)字PCR的效果。同時，對于每個擴(kuò)增區(qū)域的分析使得我們可以有效剔除副產(chǎn)物，這使得我們的技術(shù)可以從根本上解決非特異性擴(kuò)增在核酸定量中的影響，從而對于微量樣本達(dá)到更精確的定量。”

本文核心作者之一上海市實驗醫(yī)學(xué)研究院院長王華梁院長介紹道：“本方法的最大優(yōu)勢主要是速度快，檢測線性范圍大，所以適合于任何需要檢測靈敏度高，快速出結(jié)果的場景。其中的原位擴(kuò)增與以前的in situ的雜交反應(yīng)是不同的，這個on site的技術(shù)凸顯的是PCR的過程，具有新的科學(xué)意義，也使得qPCR的反應(yīng)體系能夠呈現(xiàn)出dPCR的效果。”

本文通訊作者田楨干主任介紹道：“相較于傳統(tǒng)手段，新技術(shù)檢測速度更快，同時具有更高的靈敏度，該項新技術(shù)的應(yīng)用將極大地提升口岸的檢測效率。我們相信這種技術(shù)將會在未來持續(xù)發(fā)展，為我們的口岸現(xiàn)場快速檢測工作帶來更多的便利?！?/p>

本文通訊作者劉博博士介紹道：“本文是利用半導(dǎo)體芯片技術(shù)來實現(xiàn)超快PCR檢測，利用了芯片高加工精度、高可靠以及硅材料的高熱導(dǎo)性等特性。當(dāng)芯片技術(shù)應(yīng)用到生命科學(xué)研究課題中的時候，往往會有一些令人意想不到的驚喜，比如利用硅基核酸檢測芯片我們發(fā)現(xiàn)不光實現(xiàn)了快速核酸檢測，還由于硅基核酸芯片中分子擴(kuò)散局域化的特征，在低拷貝數(shù)的情況下還能實現(xiàn)同數(shù)字PCR一樣的絕對定量，這也是信息技術(shù)同生物技術(shù)交叉融合所帶來新的發(fā)現(xiàn)，同時團(tuán)隊在完成核酸檢測芯片研發(fā)過程中還打通了不同材料異質(zhì)集成封裝的全鏈條。駟格生物作為一家致力于利用信息技術(shù)服務(wù)生命科學(xué)的創(chuàng)新型企業(yè)，將繼續(xù)深耕芯片微納制造領(lǐng)域，結(jié)合不同應(yīng)用端未來還將帶來更多的創(chuàng)新產(chǎn)品和技術(shù)?！?/p>

本文通訊作者陳昌博士介紹道：“本文的工作是非常典型的生物與信息技術(shù)跨界融合的代表，我們將具有特殊熱學(xué)設(shè)計的微納硅基芯片應(yīng)用在核酸擴(kuò)增領(lǐng)域，不僅能實現(xiàn)生物反應(yīng)的加速，而且還能額外實現(xiàn)單分子水平的不同靶標(biāo)鑒定。同時，我們也是學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的一個非常好的跨界合作，上海大學(xué)微電子學(xué)院的研究生、駟格生物的技術(shù)人員能夠在工研院和微系統(tǒng)所的產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新體系中得到成長，前沿技術(shù)能夠與現(xiàn)實應(yīng)用充分結(jié)合?！?/p>

審核編輯：劉清