基于微流控組裝的探針鎖定系統(tǒng)實現(xiàn)無標記miRNA檢測

微小RNA（miRNA）是一種約有19至24個核苷酸的非編碼RNA，具有高度保守性、時序性和組織特異性。miRNA廣泛存在于各種真核細胞中，作為基因表達的重要內(nèi)源性調控因子，與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。有研究表明，乳腺癌、肺癌、前列腺癌等癌癥的共同特征是miRNA的異常表達。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以作為一種非侵入性的血液、尿液、唾液分析的生物標志物，在疾病早期篩查與診斷等領域中具有較大應用潛力。

然而，由于miRNA序列較短，而且各種miRNA之間相似度非常高，這些特點對檢測方法的適用性和特異性提出了要求。再加上檢測過程中復雜樣品的蛋白質和脂質的干擾，使得miRNA的檢測并不容易?，F(xiàn)有的檢測方法通常需要復雜的程序來分離、提取和富集miRNA，常常依賴于昂貴的設備和訓練有素的操作人員。這些要求限制了現(xiàn)有方法在資源有限的環(huán)境下對復雜生物樣本的分析應用。因此，開發(fā)一種操作便捷、成本低廉且可靈敏檢測復雜樣本中的miRNA的方法，有助于降低miRNA檢測實驗對于環(huán)境、人員等的高要求，拓展miRNA檢測的實驗場所。

近日，首都師范大學張璐團隊基于微流控可控組裝技術，設計制備出了一種探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)并將其應用于無標記miRNA檢測中，實現(xiàn)了miRNA的低成本、高靈敏度檢測。該論文以“Label-free microRNA detection using a locked-to-unlocked transforming system assembled by microfluidics”為題，發(fā)表在Lab on a chip期刊上。

具體而言，研究人員利用微流控技術高效合成了探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)，該系統(tǒng)的核心成員是DNA序列（G4m）與鏈霉親和素磁珠（MBs）的復合物，簡稱為MBs-G4m。G4m的序列包含miRNA識別序列和富含鳥嘌呤的富G序列。G4m的兩端修飾了生物素，MBs的表面修飾了鏈霉親和素，使用微流控技術將兩者通入微通道內(nèi)進行可控結合。

經(jīng)過參數(shù)優(yōu)化，研究人員得到了G4m兩端均修飾在同一MBs表面上的復合物，即MBs-G4m。該復合物中的G4m兩端被固定，G4m中的富G序列無法自由折疊，使得體系處于探針鎖定系統(tǒng)。當該體系遇到目標miRNA時，MBs-G4m復合物中的miRNA識別序列會捕獲目標miRNA，形成DNA/RNA雙鏈。

此時溶液中的雙特異性核酸酶發(fā)揮作用，將DNA/RNA雙鏈中的DNA（miRNA識別序列）降解，目標miRNA會被釋放回溶液中進行下一次循環(huán)。降解之后，MBs-G4m復合物進入解鎖狀態(tài)，G4m的一端被釋放，富G序列可以自由折疊，從而完成了由鎖定到解鎖的轉換。

在解鎖狀態(tài)下，研究人員通過磁分離技術將MBs-G4m復合物從復雜樣本中分離出來。解鎖態(tài)復合物中的富G序列可以與血紅素組裝形成G-四鏈體/血紅素DNA酶。利用該DNA酶催化底物顯色的能力，將目標miRNA的數(shù)量信息轉換成易于測定的吸光度信息，從而實現(xiàn)了血清等復雜樣本中miRNA的定量檢測（圖1）。

圖1 （a）探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)檢測miRNA原理圖；（b）檢測miRNA的顏色變化圖

綜上所述，研究人員利用微流控技術高效合成了探針鎖定-解鎖可轉換系統(tǒng)，只需2分鐘就可以制備出足夠的MBs-G4m復合物用于miRNA檢測實驗。該復合物擁有良好的磁響應性和miRNA報告能力，可以通過磁分離減少復雜基質中干擾組分對miRNA檢測的影響，實現(xiàn)復雜生物樣本中miRNA的準確、簡便的定量分析。這種基于微流控技術快速合成探針的新檢測體系為在復雜基質中靈敏且方便的檢測miRNA提供了一種新的思路。

審核編輯：劉清