基于數(shù)字微流控技術(shù)的上呼吸道易感病毒多靶標(biāo)快速檢測(cè)方法

呼吸道病毒感染由于其高致病率及致死率，成為世界各國人民發(fā)病和死亡的主要原因之一。引起上呼吸道感染的病毒種類較多，尤其是甲型流感病毒新型H5N1（FluA-H5N1）、甲型流感病毒新型H1N1（FluA-H1N1）、乙型流感病毒（FluB）、冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、新型冠狀病毒（2019-nCOV）等病毒在近一個(gè)世紀(jì)以來的多次大規(guī)模流行，給人類的生命健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來巨大傷害。

這些上呼吸道感染的病毒引起的感染癥狀和季節(jié)性流行病毒特點(diǎn)相似，為避免造成群聚傳染，快速鑒別呼吸道病原體的檢測(cè)顯得尤為重要。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，拱北海關(guān)技術(shù)中心等科研機(jī)構(gòu)于《熱帶醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表研究性論文，將RT-qPCR技術(shù)和數(shù)字微流控技術(shù)相結(jié)合，建立一種基于數(shù)字微流控RT-qPCR芯片技術(shù)的上呼吸道易感病毒多靶標(biāo)快速檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)一種以少量樣品同時(shí)快速檢測(cè)多個(gè)呼吸道病原體的檢測(cè)技術(shù)。該方法滿足了目前市場(chǎng)對(duì)呼吸道病原體的高診斷率的需求，同時(shí)還為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的檢驗(yàn)手段。

為實(shí)現(xiàn)一個(gè)芯片多個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)功能，研究人員將6個(gè)引物（2019-nCOV-N引物、2019-nCOV-Orf1引物、FluA-M1引物、FluB-HA引物、SARS-65引物、MERS-62引物）和相應(yīng)探針分別預(yù)存到芯片的各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)中，并向反應(yīng)點(diǎn)添加引物預(yù)存液，而后將芯片置于風(fēng)干干燥箱中干燥，接著將干燥好的芯片取出進(jìn)行封裝處理。

芯片設(shè)置6個(gè)反應(yīng)點(diǎn)，從左往右依次是預(yù)存的2019-nCOV-N引物、2019-nCOV-Orf1引物、FluA-M1引物、FluB-HA引物、SARS-65引物和MERS-62引物

為了驗(yàn)證該數(shù)字微流控RT-qPCR芯片的檢測(cè)性能，研究人員使用TE緩沖液將陽性質(zhì)粒10倍稀釋為10 pg/μL至0.01 fg/μL的濃度梯度，并根據(jù)RT-qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，完成各單項(xiàng)目的引物、探針在AGS4800實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上的檢測(cè)下限檢測(cè)。

同樣，對(duì)相應(yīng)濃度的質(zhì)粒使用數(shù)字微流控芯片完成實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR反應(yīng)。如圖2所示，6種引物在AGS4800實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上均可檢出對(duì)應(yīng)的陽性質(zhì)粒，對(duì)于10 pg/μL的質(zhì)粒均可在20個(gè)循環(huán)之前檢出，且45個(gè)循環(huán)內(nèi)無非特異性擴(kuò)增。

圖2 檢測(cè)試劑測(cè)試結(jié)果

此外，F(xiàn)luA、FluB、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCOV這5個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目使用PCR儀的25 μL體系最低可檢出0.01 fg/μL的質(zhì)粒，而數(shù)字微流控RT-qPCR芯片法每個(gè)反應(yīng)最低可檢出0.1 fg/μL的質(zhì)粒，與PCR儀2 μL體系靈敏度相同。根據(jù)公式，質(zhì)?？截悢?shù)濃度 =（質(zhì)粒濃度×摩爾系數(shù)）/（質(zhì)粒長(zhǎng)度×堿基對(duì)平均分子量），分別計(jì)算2種方法中的每個(gè)反應(yīng)的質(zhì)?？截悢?shù)可得知，上述2種方法在2~25μL的體系下檢出限均為12~15拷貝/反應(yīng)，檢測(cè)下限基本一致（圖3）。

圖3 數(shù)字微流控RT-qPCR芯片的檢測(cè)下限測(cè)試結(jié)果

最后，為明確該數(shù)字微流控RT-qPCR芯片的檢測(cè)靈敏度和特異性，研究人員同時(shí)使用數(shù)字微流控RT-qPCR芯片和RT-qPCR儀檢測(cè)20個(gè)臨床標(biāo)本（包含新冠病毒2例，甲型流感8例，乙型流感6例）的5項(xiàng)呼吸道病毒項(xiàng)目，共計(jì)100個(gè)測(cè)試反應(yīng)，見表1。

結(jié)果顯示微流控芯片除樣品7出現(xiàn)一次對(duì)甲型流感病毒漏檢外，其余陽性樣品均檢出對(duì)應(yīng)病毒，對(duì)于20個(gè)樣品的5種病毒的總靈敏度為94%，總特異性為100%。Kappa值 = 0.962，兩個(gè)檢測(cè)方法具有高度一致，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

表1 PCR儀和微流控芯片檢測(cè)臨床樣本結(jié)果匯總

綜上所述，該研究將多個(gè)RT-qPCR檢測(cè)項(xiàng)目與數(shù)字微流控檢測(cè)芯片結(jié)合，建立了在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目的數(shù)字微流控RT-qPCR芯片。該數(shù)字微流控芯片RT-qPCR法可以以最少的樣本量快速檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目，自動(dòng)化程度更高，可以提高上呼吸道病毒檢測(cè)的效率，提高應(yīng)對(duì)大規(guī)模疫情的快速反應(yīng)能力。

審核編輯：劉清