時間分辨熒光結合微流控芯片技術，應用于肌紅蛋白的便捷檢測

急性心肌梗死（AMI）是由冠狀動脈粥樣硬化引起的健康問題，有著較高發(fā)病率和死亡率。心電圖（ECG）是目前用于測量和診斷心臟節(jié)律異常的主要方法，在心臟病的診斷中具有重要地位。但局限于許多AMI早期患者沒有明顯的ECG改變，ECG往往無法診斷早期AMI。為了克服這些缺點，對AMI的生物標志物進行有效檢測成為了很好的策略。肌紅蛋白是一種重要的細胞質(zhì)血紅素蛋白，存在于所有肌肉中。當心肌壞死時，血清肌紅蛋白水平在1～3 h內(nèi)升高，通常在6～9 h時內(nèi)達到峰值，在24 h內(nèi)恢復正常。因此，當肌紅蛋白含量升高時，可以提示早期心肌梗死癥狀，是一種具有較高特異性和敏感性的AMI的生物標志物。因此，在生命科學領域，肌紅蛋白的檢測方法有著較為廣泛的研究。

時間分辨熒光側流層析技術是一種靈敏度高、檢測時間短、可用于現(xiàn)場篩查的定量檢測技術，盡管其具有諸多優(yōu)勢，但也存在一些不足：對免疫層析技術來講，測試條之間的重復性問題是最大的挑戰(zhàn)，而重復性差大部分原因在于該技術采用層析膜以及其他薄膜進行檢測，需要保證液體流動一致性。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，針對上述不足，湖南大學唐昊課題組研究設計了一種時間分辨熒光結合微流控芯片技術，并將其作為肌紅蛋白的便捷檢測方法，以期解決重復性差的問題，并提高分析過程的自動化程度。相關研究成果以論文形式于近期發(fā)表于《中國科技論文在線精品論文》期刊。

該檢測方法原理如圖1所示。首先，將氨基化玻片作為肌紅蛋白抗體的固相載體，利用馬來酰亞胺與巰基的邁克爾加成法實現(xiàn)肌紅蛋白抗體的固定。同理可將肌紅蛋白抗體Myo-Ab3固定于時間分辨熒光微球（TRFM）上。隨后，將抗體化玻片預先埋入微流控芯片中，并通過抗原-抗體的特異性結合向已標記肌紅蛋白抗體Myo-Ab3的時間分辨熒光微球中加入100 μL肌紅蛋白抗原Myo-Ag1，得到時間分辨熒光微球-肌紅蛋白抗體的復合結構。接著，將反應混合液從進樣口加入到進樣室后垂直放置微流控芯片，通過重力作用使混合液流至玻片處與其反應，得到時間分辨熒光微球-抗體1-抗原-抗體2-玻片的雙抗體夾心復合物，此反應過程持續(xù)2 min，反應溫度為37℃。該復合物經(jīng)過持續(xù)2 min的洗滌過程后可直接在玻片上進行檢測，實驗操作簡單。

圖1 時間分辨熒光結合微流控芯片技術應用于肌紅蛋白的便捷檢測原理示意圖

引入微流控芯片后，研究人員利用免疫色譜讀取儀測量熒光強度考察了該體系的可行性。結果如圖2a所示，沒有肌紅蛋白抗原存在時，玻片的熒光值較低，說明由于缺少抗原抗體的特異性結合，玻片上無法形成抗原-抗體的復合結構；而當加入含有263 ng/mL的肌紅蛋白抗原的溶液時，玻片的熒光值明顯升高，說明玻片上的肌紅蛋白抗體Myo-Ab2與標記抗體時間分辨熒光微球-抗原的復合結構發(fā)生反應，因此時間分辨熒光微球被成功固定于玻片上，熒光強度大大增強。此結果表明該檢測體系是可行的。另外，還得到了在263 ng/mL，26.3 ng/mL以及2.63 ng/mL 3種不同濃度抗原下熒光的信噪比，結果如圖2b所示，隨著肌紅蛋白抗原濃度的增加，信躁比逐漸增大，表明了該免疫檢測體系對于不同濃度抗原的成功響應。

圖2 微流控芯片方法的可行性考察實驗結果圖：（a）有無肌紅蛋白抗原存在時的熒光強度對比；（b）免疫檢測體系對于不同濃度肌紅蛋白抗原的響應情況

隨后，為考察引入微流控芯片的免疫體系的檢測靈敏度，在最佳反應條件下對一系列不同濃度的肌紅蛋白進行檢測。如圖3b所示，當肌紅蛋白抗原的濃度在0～100 ng/mL范圍內(nèi)時，熒光強度和肌紅蛋白抗原的濃度呈現(xiàn)線性關系，相關系數(shù)R2為0.9879，評估檢測下限為3.85 ng/mL，檢測靈敏度較高，該檢測方法和很多其他檢測方法相比，靈敏度相當。

圖3 引入微流控芯片的免疫體系中不同濃度肌紅蛋白抗原對應的熒光檢測結果：（a）熒光信躁比結果；（b）線性擬合工作曲線

綜上所述，為解決時間分辨熒光免疫層析定量檢測技術重復性差的缺陷，該研究設計并開發(fā)了一種新型免疫法，將時間分辨熒光技術與微流控芯片技術相結合，對肌紅蛋白進行高效率檢測，僅十分鐘內(nèi)便可完成檢測全過程。該檢測方法將試劑反應、樣品分離、產(chǎn)物檢測等過程集中于一塊微小尺寸的芯片上，提高了分析過程的自動化程度。此外由免疫色譜讀取儀檢測出的熒光信號強度與抗原濃度成正比，因此該方法可以作為定量分析的依據(jù)，并且得出此新型免疫方法檢測肌紅蛋白的最低檢測限為3.85 ng/mL，靈敏度較高。該方法具有實驗重復性好、操作簡單、成本低廉、檢測限低、自動化程度高等特點，適用于肌紅蛋白的臨床檢驗。

論文鏈接： http://highlights.paper.edu.cn/index/paper_detail/7153

審核編輯 ：李倩