用于跟蹤單個(gè)分枝桿菌細(xì)胞中藥物反應(yīng)動力學(xué)

藥物療效的臨床前分析是藥物開發(fā)的關(guān)鍵。然而，傳統(tǒng)的群體細(xì)胞分析只能靜態(tài)評估平均群體行為，對藥物逃逸細(xì)胞的分辨率較低。而對療效的不準(zhǔn)確評估，往往要么導(dǎo)致高估候選藥物的療效，但無法在臨床得到證實(shí)，要么則導(dǎo)致有價(jià)值的候選藥物被拒。延時(shí)微流控顯微鏡是一種高時(shí)空分辨率的藥物表征方法，但目前還難以大規(guī)模應(yīng)用。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，法國巴黎大學(xué)（Université de Paris）的研究人員報(bào)道了一種以液壓氣動機(jī)制運(yùn)行的模塊化微流控細(xì)胞培養(yǎng)室，其特點(diǎn)是具有特別高的縱橫比。通過復(fù)制該功能單元，并將其與雙入口微流控稀釋系統(tǒng)相結(jié)合，研究人員得到了一個(gè)可以同時(shí)設(shè)置五種藥物濃度條件的微流控平臺。

該微流控平臺由兩個(gè)入口和一系列蛇形微通道組成，這些微通道依次通過五個(gè)獨(dú)立的腔室組實(shí)現(xiàn)對流入溶液的滴定。最終，通過寬視場倒置顯微鏡對這些腔室進(jìn)行時(shí)間分辨觀測，研究人員能夠直接捕捉到單個(gè)分枝桿菌細(xì)胞在給藥前、給藥中和給藥后的生長情況、死亡率和存活率。

圖1 連接到多通道微流控流量控制器（Fluigent）的五條件微流控裝置示意圖。第一個(gè)通道首先連接到三個(gè)獨(dú)立的儲液池，隨后依次連接到一個(gè)由軟件控制的雙向位置閥，以實(shí)現(xiàn)不同濃度條件的切換。

生成不同的梯度模式來模擬藥物動力學(xué)

如圖2a所示，為了在五條件微流控平臺中產(chǎn)生濃度梯度，研究人員從進(jìn)樣口注入兩種不同的溶液，使之分別流入兩個(gè)獨(dú)立的蛇形微通道。隨后，后者分叉為外部和內(nèi)部兩個(gè)蛇形微通道，其中外部蛇形微通道中的溶液保持原來的濃度，而內(nèi)部的蛇形微通道充當(dāng)混合器，使流入的溶液在此混合。

接著，三個(gè)蛇形微通道中的每一個(gè)都繼續(xù)分叉，產(chǎn)生兩個(gè)外部蛇形微通道和兩個(gè)混合器，之后進(jìn)一步分叉并產(chǎn)生最后一個(gè)包含兩個(gè)外部蛇形微通道和三個(gè)內(nèi)部混合器的稀釋水平。在每個(gè)稀釋水平下，蛇形微通道內(nèi)的流量是相同的，而在每個(gè)分支的連接部分，流向系統(tǒng)外部的流量更大，流向系統(tǒng)內(nèi)部的流量更小。

這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的濃度梯度是線性的。從最后一個(gè)稀釋水平開始，溶液流入五個(gè)獨(dú)立的腔室組（C1-C5），每個(gè)腔室組有四個(gè)微腔室。最后，每組腔室連接到相同的出樣口，以最大限度地提高整個(gè)微系統(tǒng)的流動穩(wěn)定性。

圖2 五條件平臺的梯度構(gòu)造表征

此外，為了量化濃度梯度，研究人員將溶入異硫氰酸熒光素（FITC）的7H9培養(yǎng)基溶液注入第一個(gè)進(jìn)樣口，并將不含熒光的7H9培養(yǎng)基溶液注入第二個(gè)進(jìn)樣口。研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)態(tài)下，測得的梯度與理論預(yù)期相差最小，此時(shí)，F(xiàn)ITC溶液在C1中未稀釋，在C2中稀釋到約72%，在C3中稀釋到約48%，在C4中稀釋到約25%，在C5中不存在。

為了模擬典型的PK曲線，研究人員還生成了脈沖形的FITC梯度，其峰值濃度與靜態(tài)梯度得到的濃度不同。其中，F(xiàn)ITC溶液在峰值濃度時(shí)，其在C1中未稀釋，在C2中稀釋到約82%，在C3中稀釋到約54%，在C4中稀釋到約21%，在C5中不存在。

通過雙向開關(guān)閥，在不同時(shí)間間隔交替灌注非熒光和熒光溶液，可以產(chǎn)生靜態(tài)和動態(tài)梯度。有趣的是，只有在進(jìn)樣口上游集成了電容時(shí)，才能獲得模擬PK的脈沖形梯度?？傊?，通過將稀釋樹網(wǎng)絡(luò)與微流控培養(yǎng)室集成，研究人員創(chuàng)建了一個(gè)適合在空間和時(shí)間上滴定分子的微流控平臺。

莫西沙星對恥垢分枝桿菌微菌落的作用具有劑量和時(shí)間依賴性

為了測試平臺的運(yùn)行，研究人員研究了不同藥物濃度對恥垢分枝桿菌生長速度的影響。其中，研究人員重點(diǎn)研究的莫西沙星是一種靶向II型拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA旋轉(zhuǎn)酶的氟喹諾酮類藥物，其在抗擊多藥耐藥菌株的抗結(jié)核治療過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了監(jiān)測莫西沙星對靶標(biāo)的影響，研究人員通過將系統(tǒng)中的mCherry基因與GyrA染色體融合，生成了GyrA的紅色熒光報(bào)告基因。

研究發(fā)現(xiàn)，在不存在莫西沙星的情況下，細(xì)菌呈指數(shù)級生長，但隨著藥物濃度的增加，細(xì)菌的微菌落大小顯著地逐漸減小，在最高濃度時(shí)，細(xì)菌的生長迅速停止。且與未給藥的細(xì)胞相比，研究人員觀察到最高濃度的莫西沙星顯著抑制靶標(biāo)，而較低濃度的莫西沙星會誘導(dǎo)靶標(biāo)。

此外，在給藥的前6小時(shí)，研究人員沒有測量到在不存在藥物或存在不同濃度藥物的情況下微菌落生長速率的顯著變化。而在給藥的最后6小時(shí)，微菌落生長速率開始顯著放緩，并在無藥物的恢復(fù)階段繼續(xù)下降。此外，研究人員觀察到在相同給藥濃度下，克隆微菌落生長速度存在顯著異質(zhì)性。

最后，研究人員檢驗(yàn)了體外模擬的PK參數(shù)與生長速率是否相關(guān)。有趣的是，研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥濃度高于最小抑制濃度（MIC）時(shí)，細(xì)菌生長速率與劑量（R2 = 89.8%）和時(shí)間（R2 = 90.8%）之間都存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。相比之下，研究人員發(fā)現(xiàn)生長速率與曲線下面積（AUC）和MIC的比值之間沒有顯著相關(guān)性。

總之，研究人員利用該微流控平臺在高細(xì)胞分辨率下分析了PD性質(zhì)以及PD-PK關(guān)系，發(fā)現(xiàn)莫西沙星對恥垢分枝桿菌微菌落的作用具有劑量和時(shí)間依賴性。

圖3 莫西沙星脈沖梯度對恥垢分枝桿菌GyrA-mCherry報(bào)告基因的作用

總的來說，這項(xiàng)工作是首個(gè)用于生長緩慢的細(xì)菌細(xì)胞的單細(xì)胞劑量-反應(yīng)試驗(yàn)的概念驗(yàn)證工作，該研究中創(chuàng)建的微流控平臺具有良好的在高時(shí)空分辨率下研究PK-PD關(guān)系的能力。此外，與間接推斷藥物耐受細(xì)胞存在的群體細(xì)胞分析方法不同，該微流控平臺允許直接檢測不同的單細(xì)胞在藥物作用下隨時(shí)間的變化，為藥物發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)進(jìn)步。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41598-022-24175-9

審核編輯：劉清