mTORC1高活性的干細(xì)胞樣狀態(tài)腫瘤細(xì)胞類(lèi)型分析

干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的Midkine表達(dá)驅(qū)動(dòng)mTOR

抑制和免疫抑制微環(huán)境的持續(xù)

（一）

摘要

mTORC1在多種癌癥類(lèi)型中異?；钴S。此研究對(duì)結(jié)節(jié)性硬化綜合癥(TSC)與mTORC1極度活躍相關(guān)的腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析、配對(duì)T細(xì)胞受體(TCR)測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組分析，并通過(guò)腫瘤調(diào)節(jié)的免疫抑制性巨噬細(xì)胞確定了一種與T細(xì)胞功能障礙有關(guān)的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞狀態(tài)（SLS）。雷帕霉素及其衍生物(rapalogs)是治療TSC腫瘤的主要藥物，干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞在體外表現(xiàn)出雷帕霉素耐藥，這讓研究者聯(lián)想到這些藥物對(duì)患者細(xì)胞的抑制作用。促血管生成因子midkine (MDK)在SLS群體中高度表達(dá)，并在SLS優(yōu)勢(shì)樣本中與內(nèi)皮細(xì)胞的富集相關(guān)。MDK抑制與雷帕霉素在體內(nèi)外協(xié)同抑制TSC細(xì)胞系的生長(zhǎng)。綜上所述，本研究提示mTORC1高活性的干細(xì)胞樣狀態(tài)腫瘤細(xì)胞通過(guò)免疫抑制，存在一種自分泌雷帕霉素耐藥機(jī)制和旁分泌腫瘤生存機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

AML 和 LAM的單細(xì)胞分析

研究者對(duì)腫瘤切除時(shí)獲得的6個(gè)腎性AML腫瘤和4個(gè)正常組織進(jìn)行scRNA-Seq和scTCR-Seq（圖1a）。在肺移植時(shí)獲得的5個(gè)LAM組織也進(jìn)行了scRNA-Seq。過(guò)濾掉低質(zhì)量的細(xì)胞后，共分析了來(lái)自AML的108,071個(gè)細(xì)胞和來(lái)自匹配的正常腎臟的33,136個(gè)細(xì)胞；分析了LAM肺部樣本的42,202個(gè)細(xì)胞。AML組織和正常組織的免疫和基質(zhì)區(qū)的主要細(xì)胞類(lèi)型見(jiàn)圖1b, c。正常腎臟含有49%的上皮細(xì)胞，而AML中只有1.1%的上皮細(xì)胞（圖1d）。與正常組織相比，許多免疫類(lèi)細(xì)胞在腫瘤組織中被富集，包括巨噬細(xì)胞（18.3% vs 2.7%）、樹(shù)突狀細(xì)胞（4% vs 0.7%）和T細(xì)胞（32.6% vs 14.1%）。在LAM組織中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞類(lèi)型包括免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞）、間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和血液）（圖1e）。

AML細(xì)胞中的通路和遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的圖譜

對(duì)間質(zhì)細(xì)胞群的重新聚類(lèi)顯示了來(lái)自正常腎組織和AML腫瘤組織的獨(dú)立細(xì)胞群（圖1f）。除了AML細(xì)胞（如上所述），該集群還包含腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞（TAF）。通過(guò)Seurat的差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與TAF和正常腎臟相比，160個(gè)基因在腫瘤細(xì)胞中唯一上調(diào)，包括以前報(bào)道的基因（如GPNMB、SQSTM1/p62、MMP2、PTGDS）和參與腫瘤轉(zhuǎn)移的基因（如MMP11、MDK、DCN、PDPN）（圖1g，補(bǔ)充圖3b，補(bǔ)充數(shù)據(jù)1）。與匹配的正常間質(zhì)細(xì)胞相比，兩個(gè)長(zhǎng)的非編碼RNAs（lncRNAs）（MALAT1，NEAT1）在腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞中都被上調(diào)（圖1g和補(bǔ)充圖3c），表明AML細(xì)胞重塑了成纖維細(xì)胞。為了確定AML細(xì)胞與TAF和正常腎臟的不同調(diào)節(jié)途徑，研究者使用了基因集變異分析（GSVA）。標(biāo)志性的基因集分析（包含50個(gè)基因集）確定了參與膽固醇平衡的基因是AML細(xì)胞中上調(diào)最多的途徑，而第二大上調(diào)途徑是mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)，這是在AMLs和LAM中TSC2損失的一個(gè)眾所周知的生化效應(yīng)（圖1h）。研究者使用SCENIC分析發(fā)現(xiàn)：在AML細(xì)胞中更多的調(diào)控因子被上調(diào)。該分析還確定了與AML相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)子，包括參與表觀(guān)遺傳調(diào)控的幾個(gè)因子，如HDAC2、SIRT6、FOXN3、MEF2A（圖1i，補(bǔ)充圖3d。補(bǔ)充資料2、3）。所關(guān)注的具體基因包括MDK（在此新發(fā)現(xiàn)的在AML中高表達(dá)的基因）和GPNMB（AML的一個(gè)已知標(biāo)記）。研究者使用RNA原位雜交，在AML腫瘤中檢測(cè)到MDK的表達(dá)，但在鄰近的正常腎臟中沒(méi)有檢測(cè)到（圖1j）。MDK是一種肝素結(jié)合的生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成。

圖1. 血管肌瘤（AML）和淋巴管瘤?。↙AM）的單細(xì)胞圖譜

AML腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為兩種主要狀態(tài):干細(xì)胞樣和炎性

對(duì)6596個(gè)AML細(xì)胞進(jìn)行重新聚類(lèi)顯示了四個(gè)細(xì)胞群（圖2a，b）。Custer 1顯示中胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子21（TCF21）的相對(duì)高表達(dá)，這是平滑肌細(xì)胞表型調(diào)節(jié)的主調(diào)控因子（圖2b，補(bǔ)充圖4b）。他們注意到幾個(gè)基因（SOX4，TCF4）（圖2b，補(bǔ)充圖4c），已知是干細(xì)胞標(biāo)志物。研究者計(jì)算 "干性評(píng)分"并發(fā)現(xiàn)：群組1顯示出最高的干性分?jǐn)?shù)（圖2c），并顯示出炎癥基因的高表達(dá)（圖2b，補(bǔ)充圖4e）。基于這些特征，他們將聚類(lèi)1定義為干細(xì)胞樣狀態(tài)（SLS），聚類(lèi)2定義為炎癥狀態(tài)（IS）。嘌呤相關(guān)的代謝與mTORC1途徑有關(guān)，高水平的嘌呤核苷酸是維持癌癥干性所必需的，而外部補(bǔ)充次黃嘌呤則會(huì)促進(jìn)腫瘤干性。研究者從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中產(chǎn)生了偽Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，兩種腫瘤細(xì)胞狀態(tài)下嘌呤途徑中鳥(niǎo)嘌呤/鳥(niǎo)苷的代謝都升高了（圖2d）。

人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到，缺氧的微環(huán)境以及轉(zhuǎn)移過(guò)程中誘發(fā)的壓力會(huì)引發(fā)休眠狀態(tài)，使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物治療和壓力產(chǎn)生抗性。研究者進(jìn)一步分析一組休眠標(biāo)記基因，發(fā)現(xiàn)在SLS群體中高表達(dá)（群集1），包括轉(zhuǎn)錄因子NR2F1（圖2e）。NR2F1通過(guò)整合靜止和生存的表觀(guān)遺傳程序，成為誘導(dǎo)和維持腫瘤干細(xì)胞休眠的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。Regulon分析證實(shí)，NR2F1 regulon活性在SLS（群集1）中被上調(diào)（圖2f）。并且雌二醇處理增加了NR2F1的表達(dá)和regulon活性（圖2g）。研究者通過(guò)對(duì)SLS和IS的marker（MDK和TAGLN，圖2i）以及Cathepsin K（AML/LAMmarker基因）進(jìn)行共染色，在腫瘤樣本中鑒定到了SLS和IS群體。量化顯示MDK和TAGLN幾乎沒(méi)有共定位，而MDK與CTSK或TAGLN與CTSK廣泛共染（圖2j），支持存在兩個(gè)不同的AML細(xì)胞群，MDK+和TAGLN+。

LAM中出現(xiàn)的細(xì)胞群與AML中觀(guān)察到的兩種類(lèi)型相似

遺傳學(xué)研究顯示，AML和LAM的細(xì)胞來(lái)自一個(gè)共同的前體細(xì)胞。為了確定在AML中發(fā)現(xiàn)的兩種細(xì)胞狀態(tài)是否存在于肺部LAM中，研究者使用與AML相同的標(biāo)記基因組和方法分析了五個(gè)LAM肺部的57186個(gè)細(xì)胞，共鑒定了375個(gè)LAM細(xì)胞（圖1e）并聚類(lèi)成了4個(gè)細(xì)胞群（圖2k）。與AML相似，一個(gè)集群表達(dá)SLS/調(diào)節(jié)性平滑肌標(biāo)志基因（集群2），另一個(gè)集群表達(dá)IS/收縮性平滑肌標(biāo)志基因（集群1）（圖2l）。還確定了一個(gè)表達(dá)所有這些基因的中間狀態(tài)（簇0）。SLS群體和中間狀態(tài)顯示出較高的干性評(píng)分（圖2m）。此外，與SLS AML細(xì)胞一樣，LAM細(xì)胞的SLS群也有NF2F1表達(dá)和調(diào)節(jié)子活性的上調(diào)（圖2n）。在LAM細(xì)胞中，VEGFD（一種有效的LAM生物標(biāo)志物）的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MDK（一種有效的血管生成和淋巴管生成的生長(zhǎng)因子）（圖2o），表明MDK在LAM相關(guān)的淋巴管生成中的潛在作用。

圖2. AML和LAM細(xì)胞狀態(tài)的異質(zhì)性

未完待續(xù)

那么AML細(xì)胞的干細(xì)胞樣細(xì)胞群與雷帕霉素耐藥相關(guān)性、異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞狀態(tài)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的重塑以及scRNA-Seq和scTCR-Seq的綜合分析如何揭示了SLS優(yōu)勢(shì)腫瘤的T細(xì)胞功能障礙和抑制的克隆擴(kuò)展請(qǐng)見(jiàn)下回詳解。

SBC 單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Single-cell RNA-sequencing）是指在單細(xì)胞水平上對(duì)RNA進(jìn)行高通量測(cè)序和分析的新技術(shù)。公司（中心）建立的單細(xì)胞測(cè)序的主流平臺(tái)——10x Genomics Chromium，可提供大規(guī)模、靈活、全面的單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)，包括單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫(kù)、單細(xì)胞ATAC-seq、單細(xì)胞ATAC+轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等。經(jīng)過(guò)多年的積累，現(xiàn)已形成從樣本保存、運(yùn)輸、單細(xì)胞懸液制備，到單細(xì)胞分選、建庫(kù)和數(shù)據(jù)分析的一站式解決方案。目前已為來(lái)源于人、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)等多種物種的臨床和科研樣本提供了單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析服務(wù)。

SBC 空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)能夠測(cè)定組織樣本中（冰凍和石蠟樣本）的所有基因表達(dá)圖譜，并定位具體發(fā)生的位置信息。公司（中心）建立的10x Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)，無(wú)需進(jìn)行目標(biāo)預(yù)設(shè)就可以在空間上實(shí)現(xiàn)組織中基因表達(dá)的可視化。通過(guò)數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)可視化，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)映射到圖像上，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣品基因表達(dá)和細(xì)胞組成空間結(jié)構(gòu)的表征，以從組織切片中獲得生物學(xué)的全貌。