乳腺癌微環(huán)境的時間分析揭示膠原蛋白XII是腫瘤轉(zhuǎn)移的驅(qū)動因素

腫瘤基質(zhì)，特別是細胞外基質(zhì)(ECM)，是實體腫瘤的一個顯著特征，在腫瘤發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。許多促結(jié)締組織增生性腫瘤，包括乳腺癌，都涉及I型膠原的顯著積聚，并且I型膠原分子的分布和結(jié)構(gòu)與其豐度在腫瘤中同等重要。此外，癌相關(guān)成纖維細胞（CAF）存在于乳腺癌組織中，通過重塑ECM發(fā)揮促腫瘤和抗腫瘤作用。

本文中，為了研究上述三者與乳腺癌發(fā)展的關(guān)系，研究者利用質(zhì)譜技術(shù)檢測ECM中的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了在腫瘤中顯著上調(diào)的膠原蛋白XII，可調(diào)節(jié)I型膠原纖維，促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，并結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組測序確認CAF是膠原蛋白XII的主要來源。

研究路線

?

研究內(nèi)容

腫瘤基質(zhì)蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化

隨著實體腫瘤生長，ECM的持續(xù)重塑導致正常組織基質(zhì)被腫瘤基質(zhì)取代，這種重塑在腫瘤進展中起著重要作用。研究者使用自發(fā)且多發(fā)性腫瘤中期（PyMT）基因工程小鼠模型（GEMM），收集早期（增生期）、中期（腺瘤）和晚期（轉(zhuǎn)移性腺癌）的乳腺癌組織和相同年齡健康小鼠的乳腺脂肪墊組織，來研究乳腺癌發(fā)生過程中ECM隨時間的變化。

對組織進行脫細胞操作以富集ECM蛋白質(zhì)，然后進行DIA質(zhì)譜檢測蛋白質(zhì)組，在脂肪墊和腫瘤中定量到150種基質(zhì)蛋白，其中113種在腫瘤和健康脂肪墊中差異表達。這里面有71種屬于核心基質(zhì)蛋白，42種與基質(zhì)相關(guān)，包括分泌因子、ECM相關(guān)蛋白和ECM調(diào)節(jié)劑。

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)了四個具有不同時間表達特征的離散clusters。C1中的蛋白質(zhì)在健康組織中隨時間逐漸上調(diào)，但在腫瘤中表達更高，并隨腫瘤發(fā)展進一步增加。C2中的蛋白質(zhì)在腫瘤三個階段與健康脂肪墊相比均上調(diào)，C3中蛋白質(zhì)則隨著疾病發(fā)展逐漸下調(diào)，C4則在早期中期下調(diào)而晚期上調(diào)。

C2中的SPP1可將乳腺成纖維細胞激活成促腫瘤的癌相關(guān)成纖維細胞（CAF），C3中的DCN在晚期腫瘤中下調(diào)且具有抗增殖和抗轉(zhuǎn)移的特性，TNXB在三個階段均下調(diào)且有報道稱該蛋白在多種實體瘤中下調(diào)且與較差的生存率相關(guān)。C4中具有腫瘤抑制作用的TINAGL1下調(diào)。這些結(jié)果強調(diào)了關(guān)鍵的ECM分子是如何在原發(fā)性乳腺癌進展中發(fā)揮重要作用，從促進腫瘤細胞增殖和侵入基質(zhì)、向脈管系統(tǒng)遷移、血管內(nèi)和血管中的傳播并導致轉(zhuǎn)移性疾病。

Fig.1 脫細胞乳腺癌蛋白質(zhì)組圖譜揭示基質(zhì)體的動態(tài)變化

膠原蛋白 XII 在乳腺癌發(fā)展過程中隨時間上調(diào)

比較健康脂肪墊和腫瘤的基質(zhì)蛋白質(zhì)組結(jié)果后發(fā)現(xiàn)了很多差異表達的ECM蛋白。其中，膠原蛋白XII（COL12A1）在所有時期的腫瘤基質(zhì)中，與健康脂肪墊相比，均顯著上調(diào)表達，且隨著腫瘤發(fā)展，其表達逐漸上調(diào)。免疫組化（IHC）驗證發(fā)現(xiàn)膠原蛋白XII主要定位于基質(zhì)區(qū)，表達變化趨勢與蛋白質(zhì)組結(jié)果一致，證實了該蛋白作為關(guān)鍵基質(zhì)支架蛋白的作用。已有報道表明膠原蛋白XII是正常組織中纖維狀膠原結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)劑，并且與腫瘤侵襲性相關(guān)。

Fig.2 隨著疾病的進展，XII膠原蛋白在乳腺癌中表達上調(diào)

膠原蛋白 XII 表達與腫瘤生物力學特性改變有關(guān)

為了評估膠原蛋白XII在原發(fā)性腫瘤進展中的潛在作用，研究者對膠原蛋白I/XII的空間組織和腫瘤生物力學進行了研究（膠原蛋白XII可與I結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)功能）。利用天狼星紅對組織中的纖維狀膠原蛋白染色和IHC切片分析發(fā)現(xiàn)在腫瘤進展過程中，總膠原蛋白與 XII 膠原蛋白一起增加。

無測限壓力測試分析測量腫瘤的生物力學特性發(fā)現(xiàn)腫瘤硬度（體積彈性模量）在疾病的晚期顯著增加，與質(zhì)譜測得的XII膠原蛋白豐度增加相關(guān)。基于I型膠原纖維的非中心對稱性質(zhì)，使用二次諧波發(fā)生（SHG）多光子成像技術(shù)對I型膠原進行無標記成像和量化。結(jié)果表明，I型膠原纖維密度在腫瘤發(fā)展的晚期上調(diào)，I型膠原纖維束尺寸的量化顯示，隨著腫瘤的進展，I型膠原束寬度增加。

隨著腫瘤從早期進展到中期和晚期，I型膠原纖維的線性度增加。這些數(shù)據(jù)證實了原發(fā)腫瘤進展過程中I型膠原纖維組織的廣泛重構(gòu)。

Fig.3 XII膠原蛋白豐度與纖維狀膠原結(jié)構(gòu)改變和腫瘤硬度相關(guān)

XII膠原蛋白在乳腺癌中表達上調(diào)，與不良預后有關(guān)

研究者使用TCGA數(shù)據(jù)庫乳腺癌隊列（BRCA）的RNA測序結(jié)果中XII膠原蛋白基因（COL12A1）表達數(shù)據(jù)進行預后研究，發(fā)現(xiàn)與非腫瘤組織相比，該基因在包括TNBC在內(nèi)的所有原發(fā)乳腺癌組織中顯著上調(diào)。XII型膠原的高表達與總體存活率低(OS)和不良的無進展生存期（PFS）顯著相關(guān)。

多變量分析表明膠原蛋白XII的表達與腫瘤早期的進展更密切相關(guān)。為了證實上述發(fā)現(xiàn)，研究者對150名患者組織的膠原蛋白XII進行IHC分析，證實該蛋白高水平與疾病特異的存活率差顯著相關(guān)，并且患者的遠端復發(fā)率也更高。上述結(jié)果表明，XII膠原蛋白的表達與早期患者預后和復發(fā)密切相關(guān)，值得進一步研究以確定其作為侵襲性轉(zhuǎn)移疾病生物標志物的潛力。

Fig.4 XII膠原蛋白表達與乳腺癌預后不良相關(guān)

單細胞轉(zhuǎn)錄組揭示CAF提供了腫瘤微環(huán)境中的膠原蛋白XII

為了確認原發(fā)腫瘤微環(huán)境（TME）中膠原蛋白XII的來源，研究者從體內(nèi)模型中收集5個原發(fā)晚期腫瘤組織進行單細胞RNA測序，證實了XII膠原蛋白編碼基因Col12a1在CAF的分泌基質(zhì)亞型高表達，在另一個26名乳腺癌患者隊列的單細胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)XII膠原蛋白的主要來源是CAF。

接下來，研究者利用該患者隊列單細胞測序結(jié)果中CAF marker基因，對TCGA隊列每個乳腺癌數(shù)據(jù)集計算了CAF分數(shù)，發(fā)現(xiàn)COL12A1的表達與CAF分數(shù)呈顯著正相關(guān)，進一步證實了CAF是乳腺腫瘤中COL12A1的主要來源。但是分析還發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白XII表達但沒有CAF分數(shù)也與總體和無進展的存活率顯著相關(guān)，將CAF分數(shù)添加到XII膠原蛋白生存模型中并不能顯著改善該模型，說明XII膠原蛋白的表達是這些患者預后的預測指標，與CAF分數(shù)無關(guān)。

Fig.5 小鼠和人乳腺癌中的CAF產(chǎn)生XII膠原蛋白

CAF分泌的XII膠原蛋白調(diào)節(jié)I型膠原結(jié)構(gòu)、組織生物力學和癌細胞侵襲

研究者分析了從原發(fā)PyMT腫瘤中分離出的CAF和腫瘤細胞后發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠乳腺成纖維細胞相比，這些CAF中的XII膠原蛋白表達上調(diào)，與單細胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。從CAF細胞中敲除COL12A1并做了大量實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)XII膠原蛋白的表達不會改變纖維膠原的總豐度，但會改變纖維膠原的超微結(jié)構(gòu)，XII膠原蛋白在決定I型膠原纖維的空間組織結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了作用，并且CAF中XII膠原蛋白的枯竭可能起到了使基質(zhì)正?；淖饔谩?br />
此外，XII膠原蛋白敲除沒有改變CAF收縮I型膠原器官型基質(zhì)的能力，而無限制壓力分析器官型基質(zhì)的生物力學特征，揭示CAF中XII膠原蛋白的耗竭導致整體基質(zhì)的硬度下降。XII膠原蛋白的敲除導致較薄的膠原束豐富程度較高，由于XII型膠原支架支撐著I型膠原的結(jié)合，這與XII型膠原已知的功能（即調(diào)節(jié)健康組織中I型膠原構(gòu)型）是一致的。

最后，在CAF重塑的器官型基質(zhì)里，先去除CAF后將PyMT癌細胞接種進去。結(jié)果表明癌細胞很容易侵襲到shScr-CAF（敲除模型的對照）重塑的基質(zhì)中，但這種能力在敲除的CAF重塑基質(zhì)中顯著降低，證實膠原蛋白 XII 對膠原蛋白 I 的調(diào)節(jié)，在原發(fā)性乳腺癌中產(chǎn)生促侵襲性微環(huán)境的重要作用。

利用Crisper激活構(gòu)建膠原蛋白XII過表達的CAF細胞系，研究者發(fā)現(xiàn)CAF過表達XII膠原蛋白并不影響膠原重塑的速度，但確實顯著增加了CAF重塑的器官型基質(zhì)的硬度和成熟的束狀膠原纖維的比例，并且顯著增加了PyMT癌細胞的侵襲性。這些結(jié)果表明，在CAF中增加XII膠原蛋白的表達與XII膠原蛋白的敲除具有相反的作用，并證實了XII膠原蛋白在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的纖維膠原結(jié)構(gòu)和基質(zhì)生物力學以及隨后的乳腺癌細胞侵襲中具有重要的作用。

Fig.6 XII膠原蛋白基因敲除調(diào)控原纖維膠原結(jié)構(gòu)并抑制癌細胞侵襲

Fig.7 XII膠原蛋白過表達增強腫瘤硬度和癌細胞侵襲

CAF分泌的XII膠原蛋白創(chuàng)造了一個促進癌轉(zhuǎn)移的微環(huán)境

為了研究CAF分泌的XII膠原蛋白的作用，研究者將癌細胞與shScr、敲除后的CAF(癌細胞與CAF的比例為1：3)原位共植入第四乳房脂肪墊，并讓腫瘤最大成長到520mm3。研究發(fā)現(xiàn)對照和敲除組的腫瘤到達最大體積的時間和腫瘤重量沒有顯著差異，但腫瘤硬度在敲除組里顯著下降。肺組織切片觀察癌轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)對照組100%轉(zhuǎn)移，而敲除組約50%左右轉(zhuǎn)移，說明XII膠原蛋白在調(diào)節(jié)基質(zhì)組織（可促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移擴散）中起著關(guān)鍵作用。

研究者還證實在敲除組腫瘤中較低的XII膠原蛋白水平降低，但兩組的CAF細胞量沒有差異。此外，I型膠原束厚度顯著減少，這與觀察到的腫瘤硬度降低相關(guān)。敲除組腫瘤中pMLC2（有研究指出pMLC2可激活腫瘤成纖維細胞并放大基質(zhì)重塑，導致腫瘤硬度增加和促進腫瘤細胞侵襲的微環(huán)境產(chǎn)生）水平顯著低于對照組，癌細胞的轉(zhuǎn)移潛力也降低。

這些結(jié)果表明，CAF中的XII膠原蛋白缺失會導致正在發(fā)展的腫瘤內(nèi)I型膠原束和腫瘤硬度改變，這可能導致基質(zhì)總體激活水平較低，并破壞允許癌細胞侵襲的微環(huán)境。利用XII膠原蛋白過表達CAF進行與上述敲除組類似的實驗進一步證實XII膠原蛋白表達在轉(zhuǎn)移擴散中的重要作用。

總之，在體外和體內(nèi)，這些互補的敲除和過表達模型實驗結(jié)果支持這樣的假設(shè)，即CAF在原發(fā)部位分泌的膠原蛋白XII調(diào)節(jié)I型膠原的結(jié)構(gòu)和腫瘤的生物力學特性，從而創(chuàng)造了允許癌轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境。

Fig.8 XII膠原蛋白基因敲除在體內(nèi)減少癌轉(zhuǎn)移

Fig.9 XII膠原蛋白過表達在體內(nèi)促進癌轉(zhuǎn)移

結(jié)果總結(jié)

本研究利用質(zhì)譜技術(shù)描繪了脫細胞腫瘤隨時間變化的蛋白質(zhì)組圖譜，揭示了乳腺癌發(fā)展過程中基質(zhì)體的演變情況。研究者確定了四個關(guān)鍵的基質(zhì)蛋白clusters，并明確指出XII膠原蛋白是調(diào)節(jié)I形膠原組織的關(guān)鍵成分。

通過將蛋白質(zhì)組學和單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，并使用遺傳操作模型，研究者展示了由CAF分泌的XII膠原蛋白是如何改變I型膠原組織，以創(chuàng)造支持轉(zhuǎn)移擴散的促侵襲微環(huán)境。此外，在TCGA的患者隊列中，研究者發(fā)現(xiàn)XII膠原蛋白可能代表了乳腺癌患者轉(zhuǎn)移復發(fā)的高風險指標。

審核編輯：劉清