立體聲流技術(shù)在微納米尺寸生化顆粒物操控中的應(yīng)用

近日，他開發(fā)出一種全新的聲流控技術(shù)——立體聲流技術(shù)（Stereo acoustic streaming，SteAS）。該技術(shù)可實現(xiàn)對低至30nm的聚苯乙烯微球片上富集和低至150nm的微球連續(xù)式聚焦和篩分，并已被用于患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞及外泌體的篩分純化。

據(jù)介紹，立體聲流技術(shù)兼具聲波操控和流體動力學(xué)操控的優(yōu)勢，具有靈活、高效、溫和等特征，很適合作為一種通用的操控技術(shù)，以用于小體積生化樣品的預(yù)處理和檢測。

在相關(guān)論文里，楊洋針對微米尺寸和納米尺寸生化顆粒物操控的不同需求開發(fā)了兩套立體聲流平臺，分別為立體聲流隧道（stereo acoustic streaming tunnel，SteAST）和自適應(yīng)虛擬微通道（self-adaptive virtual microchannel），并展示了該技術(shù)在單細(xì)胞多模式操控和外泌體篩分中的潛力。

值得強調(diào)的是，該技術(shù)應(yīng)用潛力并不限于生物樣品，任何采用離心機分離純化的場景，都能采用該技術(shù)進(jìn)行替代，材料包括但不限于金、銀、聚苯乙烯、二氧化硅、乳膠等。目前來看，床旁檢測（Point-of-care diagnostics）和液體活檢（Liquid biopsy）仍是微流控技術(shù)的各種潛在應(yīng)用中最有機會落地的場景。然而對小體積復(fù)雜生化樣品的預(yù)處理技術(shù)的發(fā)展是滯后于片上檢測技術(shù)的。

近年來，片上庫爾特計數(shù)器、數(shù)字PCR、拉曼、三代測序等技術(shù)的出現(xiàn)提供了不同維度的檢測方案，精度可達(dá)單堿基水平，但是往往需要大型設(shè)備來完成樣品的預(yù)處理。尤其是針對百納米的生物顆粒物，超速離心幾乎是唯一的方案，但是昂貴的價格、耗時的操作和高的損失率限制了超離的普及。

通過對立體聲流技術(shù)進(jìn)行多級整合，可對小體積納米顆粒進(jìn)行即時的片上多級分離、富集和檢測，縮短目前微流控技術(shù)和片上實驗室（Lab on a chip）目標(biāo)之間的距離。

用立體聲流技術(shù)，將操控極限尺寸提高至30nm

據(jù)介紹，納米顆粒物是近年來備受關(guān)注的研究目標(biāo)之一，其作為藥物載體、表面涂層或敏感單元，被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)、材料和光電子等領(lǐng)域。按性質(zhì)軟硬來區(qū)分，納米顆粒物可被分為：以有機無機材料組成的“硬”顆粒、以及各種生物納米顆粒為主的“軟”顆粒。

納米級的尺寸，讓這些顆粒物具備不同的性質(zhì)和功能。例如，不同尺寸的金納米顆粒載體有不同的代謝周期，可以通過控制其尺寸，用于調(diào)控藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。其中，外泌體作為尺寸在30-150nm的一類外泌囊泡，被認(rèn)為在細(xì)胞通訊中起到重要作用，并且是多種疾病的潛在標(biāo)志物。

盡管這些納米顆粒物具備研究價值和應(yīng)用價值。但是，昂貴復(fù)雜的純化富集技術(shù)比如超速離心、密度梯度離心、排阻色譜等，帶來了極高的硬件門檻，這讓研究規(guī)模和應(yīng)用推廣遭受限制。尤其是面對生物納米顆粒物時，其脆弱的膜結(jié)構(gòu)、同類樣品間的巨大差異和復(fù)雜的成分，對純化技術(shù)的生物兼容性、操控能力和穩(wěn)定性提出了極高的要求。

聲流控技術(shù)是一種理想的解決方案，該技術(shù)通過結(jié)合聲鑷技術(shù)和微流控技術(shù)，在微尺度的流道中引入聲波，來實現(xiàn)對顆粒物和流體的驅(qū)動。在技術(shù)原理上其類似于光鑷技術(shù)，即用聲代替光去“抓”“移動”和“推”目標(biāo)。相比于光，聲在可集成性、驅(qū)動效率和生物兼容性上有明顯優(yōu)勢。

同時，相比于復(fù)雜的光路和昂貴的光源，聲波器件往往只需電學(xué)激勵即可驅(qū)動。并且得益于與集成電路相兼容的加工工藝，其大規(guī)模加工難度較低，封裝尺寸往往能做到毫米甚至微米水平。

研究中，該團隊采用的固體狀配型薄膜體聲波諧振器的尺寸處于百微米水平，非常適合與微流控技術(shù)集成。在驅(qū)動效率上，聲波的波速遠(yuǎn)低于光波，這使得同樣的功率下能引發(fā)的聲波輻射力遠(yuǎn)高于光輻射力。

此外，在生物兼容性上，聲波作為一種非接觸的操控手段，其作用力本身是均勻溫和的，已在單細(xì)胞操控領(lǐng)域應(yīng)用多年，并已作為聚焦技術(shù)被用于商品化流式細(xì)胞儀當(dāng)中。但是，面對生命科學(xué)中復(fù)雜的操控需求和納米尺寸的顆粒物，經(jīng)典的聲流控技術(shù)無法實現(xiàn)多模式操控和納米級操控能力。

（來源：資料圖）

針對操控模式和操控能力這兩大瓶頸，楊洋和所在的天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院教授段學(xué)欣課題組開發(fā)出了立體聲流技術(shù)。與依靠聲波驅(qū)動的經(jīng)典聲流控技術(shù)不同的是，該技術(shù)通過強化聲流體效應(yīng)，在微尺度內(nèi)引發(fā)三維分布的聲流體渦旋來實現(xiàn)操控。

通過對于微流道的設(shè)計，該團隊將聲流體渦旋的尺寸限制在微米量級，并且渦旋之間可以相互連接形成一對虛擬的隧道。這時，粒子會被聚焦至隧道中心，并會在側(cè)向流的作用下向下游移動。

聲流體渦旋與微流控側(cè)向流體的配合，一方面豐富了聲波單一的驅(qū)動模式，為操控帶來了更多可能性。在單器件上也可實現(xiàn)對單細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)、捕獲、篩分、染色等多模式操控。另一方面，它也能彌補聲流控技術(shù)對納米級尺寸顆粒操控能力的不足，將操控的極限尺寸提高至30nm。

相關(guān)論文于2022年先后發(fā)表在Microsystems&Nanoengineering和Science Advances上。楊洋擔(dān)任第一作者，其導(dǎo)師段學(xué)欣擔(dān)任通訊作者。

審稿人評價稱，該技術(shù)擁有極好的性能，為聲波操控技術(shù)在生物樣品預(yù)處理中的應(yīng)用提供了一個良好范式。同時，也指出了初稿在機理解釋和作圖表達(dá)直觀程度上的不足。

為此，課題組補充了更多的機理討論和仿真展示，來說明立體聲流與各種邊界條件之間的關(guān)系和粒子在虛擬通道中的運動過程。楊洋表示：“這部分修改對不同學(xué)科背景的研究者了解我們的技術(shù)是十分重要的。”

注定是一場科研“馬拉松”

事實上，從2015年決定從器件底層設(shè)計出發(fā)進(jìn)行技術(shù)開發(fā)，就注定了該技術(shù)的研發(fā)是一場“馬拉松”。在正式立項之前，他們經(jīng)歷了兩年之久的技術(shù)探索期。

據(jù)悉，該課題組曾首次將GHz體聲波諧振器與微流控技術(shù)結(jié)合，來實現(xiàn)流體和顆粒物操控。在此之前，領(lǐng)域內(nèi)更關(guān)注GHz器件在生化傳感中帶來的靈敏度增益，學(xué)界曾以一款成功商品化的聲學(xué)傳感技術(shù)——石英晶體微天平為目標(biāo)進(jìn)行研發(fā)，并應(yīng)用在氣體檢測當(dāng)中。

在探索期，該團隊學(xué)習(xí)參考了國際知名聲流控課題組的工作，借此來解決基礎(chǔ)的封裝、進(jìn)樣和系統(tǒng)搭建等基礎(chǔ)問題，同時也發(fā)表了此次技術(shù)的第一篇論文，實現(xiàn)了多相流的混合。

2016年之后，聲流控領(lǐng)域快速發(fā)展，從純聲波主導(dǎo)的驅(qū)動模式，拓展到聲流-聲波混合驅(qū)動模式，這讓課題組意識到通過設(shè)計調(diào)整側(cè)向流、聲流和聲波的空間分布，或許能打破聲流和聲波互相干擾的耦合狀態(tài)，從而實現(xiàn)操控性能的提升。

在組內(nèi)多次討論后，該項目于2017年正式立項，經(jīng)過器件設(shè)計、仿真驗證、設(shè)計流片和基礎(chǔ)測試之后，該團隊拿到了第一版器件。

很幸運的是，第一批器件就表現(xiàn)出了遠(yuǎn)超前人的操控能力。那時，楊洋和所在團隊帶著該成果，參加了微流體領(lǐng)域最權(quán)威的國際學(xué)術(shù)會議MicroTAS 2017。

期間，與會者對三維分布的聲流很感興趣。但是，很遺憾他們當(dāng)時沒能給出完整的實驗結(jié)果和機理討論，來展示這種立體操控的特點?；貒?，課題組開始思考如何完成立體聲流的三維表征。

由于熒光顯微鏡只能觀察x-y平面，無法表征三維分布的聲流體渦旋和渦旋內(nèi)粒子的x-z平面的軌跡，而這對解釋和優(yōu)化立體聲流體又是至關(guān)重要的。

在嘗試多種方案之后，他們最終選擇改裝共聚焦顯微鏡來完成表征?！斑@里要特別感謝萊卡、蔡司、奧林巴斯的工程師們對共聚焦顯微鏡選型和改裝提供的幫助。獲得測試數(shù)據(jù)之后，經(jīng)過迭代優(yōu)化的第二版器件很快完成加工，并且達(dá)到了預(yù)期性能指標(biāo)。最終在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院任秀寶教授團隊的支持下，我們完成了真實患者樣品的分離實驗?！睏钛蟊硎?。

（來源：資料圖）

幸得學(xué)界和業(yè)界相助，相關(guān)成果均已申請專利

楊洋表示在技術(shù)、虛擬通道的自適應(yīng)性發(fā)現(xiàn)是比較意外的收獲。一開始他們只是想表征在不同濃度樣品中的富集能力。具體實驗中卻發(fā)現(xiàn)，虛擬通道會根據(jù)樣品濃度自發(fā)的擴張和收縮。

（來源：資料圖）

在高濃度樣品中，虛擬通道的直徑能擴張至幾十微米來提高載量和回收效率；在低濃度樣品中，會收縮至幾微米來提高濃縮倍數(shù)。這種虛擬管壁的彈性讓該技術(shù)具備很好的濃度兼容性，因此更加適合用于生物樣品這類批次間有顯著差異的樣品預(yù)處理。

楊洋還表示，合作者們的支持和幫助讓人同樣難忘。如今，科研的節(jié)奏越來越快，面對成果壓力，合作者能在數(shù)年的項目周期里對他們保持支持，是項目得以順利完成的重要保障。

如同之前提到的，為了拍攝立體聲流的空間分布，課題組當(dāng)時聯(lián)系和試用了市面上所有共聚焦顯微鏡，并且在工程師幫助下進(jìn)行設(shè)備的改裝。

在這期間，廠商工程師團隊、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院顯微平臺、天津醫(yī)科大學(xué)和南開大學(xué)顯微平臺老師們，都提供了寶貴的建議。此外，在生物樣品的處理和產(chǎn)物鑒定上，天津醫(yī)科大學(xué)尹海芳教授團隊提供了重要支持。

目前，相關(guān)成果全部已經(jīng)申請專利，包括發(fā)明專利三項、PCT專利（Patent Cooperation Treaty，專利合作條約）三項，具備從器件底層設(shè)計至應(yīng)用端的全流程自主知識產(chǎn)權(quán)。

此外，楊洋表示：“我們在立項初期的定位，是希望開發(fā)一種類似于離心機的通用樣品預(yù)處理工具，這要求其在擁有堪比超速離心的富集性能的同時，兼具微流控技術(shù)的小樣品的即時處理能力。”

因此，他認(rèn)為課題組接下來應(yīng)該會一方面關(guān)注該技術(shù)在應(yīng)用端的場景拓展，另一方面會根據(jù)應(yīng)用需求進(jìn)行定制和儀器化開發(fā)。

而楊洋個人的科研興趣，仍會關(guān)注對于立體聲流的操控能力和操控模式的進(jìn)一步提高和拓展。

就操控能力來說，在本文介紹的兩篇論文里，他和所在課題組分別完成了單細(xì)胞和納米粒子的操控，即百微米至數(shù)十納米水平的操控。后續(xù)，其希望通過設(shè)計優(yōu)化，來將操控能力推動到生物大分子水平。

在操控模式方面，微流控技術(shù)雖然有諸多優(yōu)勢，但是始終與生命科學(xué)研究邏輯和習(xí)慣是不符的。因此，該團隊更希望在經(jīng)典的培養(yǎng)皿-顯微鏡體系中開展研究。

針對這一需求，課題組期待能將立體聲流技術(shù)的應(yīng)用場景進(jìn)一步拓展至開放環(huán)境，這需要對機理和工作模式有更多的理解和設(shè)計，同時也是他們的重要研究方向。