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一種響應(yīng)多種芳香族和吲哚類誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器系統(tǒng)

微流控 ? 來源:微流控 ? 作者:微流控 ? 2022-05-20 09:23 ? 次閱讀

變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Allosteric transcription factor,aTF)包含幾個大的蛋白質(zhì)家族,能夠通過結(jié)合效應(yīng)物引發(fā)別構(gòu)效應(yīng)進(jìn)而準(zhǔn)確地調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。其分子機(jī)制主要是通過小分子的結(jié)合,能夠使得DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生變化,使在特定的DNA結(jié)合序列上發(fā)生結(jié)合或解離。aTF是微生物工程中的重要工具,在代謝工程、生物技術(shù)和合成生物學(xué)中都有著廣泛的應(yīng)用。 最近,加拿大康科迪亞大學(xué)(Concordia University)的研究人員在《ACS Synthetic Biology》(IF=5.11)期刊上發(fā)表了一項重要研究成果,該團(tuán)隊開發(fā)了一種響應(yīng)多種芳香族和吲哚類誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器系統(tǒng),該方法利用空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)的TetR家族阻遏物CmeR,構(gòu)建了aTF基因線路,該線路可在大腸桿菌和釀酒酵母中作為水楊酸生物傳感器,同時也證明了調(diào)節(jié)CmeR的啟動子對多種芳香和吲哚誘導(dǎo)劑也可起響應(yīng)。

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研究人員一開始發(fā)現(xiàn)來自空腸彎曲桿菌的TetR家族抑制因子——CmeR,它能夠調(diào)節(jié)外排泵來響應(yīng)腸道膽汁鹽的變化,并且CmeR還被證明可以結(jié)合水楊酸和甘油,包括脂肪族、膽汁鹽和芳香族分子,具有多配體特異性。其多配體特異性引發(fā)了研究人員的興趣,他們想利用CmeR的這一特性,設(shè)計新的基因線路。 ?首先,研究人員構(gòu)建了一個基因線路,來研究大腸桿菌中能調(diào)控CmeR的誘導(dǎo)物,其中CmeR用IPTG誘導(dǎo)的Ptac啟動子表達(dá),第二個啟動子P2表達(dá)綠色熒光蛋白(eGFP),該啟動子能響應(yīng)水楊酸。

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大腸桿菌中的基因線路 由于eGFP的啟動子響應(yīng)水楊酸,如果CmeR的表達(dá)量變大,會與P2啟動子競爭水楊酸,導(dǎo)致GFP表達(dá)降低,因此通過誘導(dǎo)CmeR的表達(dá)可以抑制熒光(即抑制eGFP的表達(dá)),而加入越來越多的誘導(dǎo)劑水楊酸,會導(dǎo)致CmeR與水楊酸結(jié)合飽和,同時激活P2啟動子,表達(dá)更多的eGFP。當(dāng)水楊酸添加到1mM時候,eGFP的表達(dá)量是添加1mM IPTG 的情況下的5倍。通過調(diào)節(jié)IPTG和水楊酸濃度,我們可以進(jìn)一步調(diào)控eGFP的表達(dá)水平。 ?接著,研究人員探索了CmeR的配體特異性。首先將攜帶該基因線路菌株去“感受”各種芳香族、吲哚和脂肪族分子。通過觀察報告基因eGFP的熒光強(qiáng)度,來表征CmeR的響應(yīng)程度。熒光強(qiáng)度的增加范圍從1.1倍(兒茶酚)到3.8倍(植物生長素吲哚-3-乙酸或IAA),同時也利用流式細(xì)胞儀表征了這些分子的劑量-響應(yīng),實驗表明除了鑒定的同源誘導(dǎo)劑外,受CmeR調(diào)節(jié)啟動子似乎也受色胺(色氨酸的胺衍生物)的最低程度誘導(dǎo),而酪胺(酪醇的胺衍生物)不誘導(dǎo)表達(dá)。

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大腸桿菌表達(dá)情況 ?之后研究人員在真核生物釀酒酵母中也實現(xiàn)了該基因線路的功能。在這個線路中,CmeR由強(qiáng)啟動子PTDH3啟動表達(dá)。綠色熒光蛋白(EnvyGFP)由強(qiáng)啟動子PCCW12表達(dá),通過修飾,使PCCW12具有水楊酸響應(yīng)性。

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釀酒酵母中的基因線路 研究人員用類似于在大腸桿菌的實驗,得到的數(shù)據(jù)也證明CmeR在釀酒酵母中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄抑制因子,并且可被水楊酸誘導(dǎo)。并且也用相同的分子對基因線路劑量-響應(yīng)的進(jìn)一步表征,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和釀酒酵母中CmeR誘導(dǎo)曲線之間存在差異,后者表現(xiàn)出最大的熒光誘導(dǎo),范圍從1.8倍(乙酰水楊酸酯)到5倍(對香豆酸酯)。

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釀酒酵母表達(dá)情況 釀酒酵母回路與大腸桿菌回路相比,釀酒酵母CmeR回路中對其中許多分子都起反應(yīng),包括對同源誘導(dǎo)物水楊酸的反應(yīng),但總體上有所減弱,這可能是由于兩種基因線路設(shè)計上差異,例如大腸桿菌是從多拷貝載體表達(dá)的,而在釀酒酵母中是單拷貝基因組整合。 ?總的來說,研究人員分別在原核生物大腸桿菌和真核生物釀酒酵母中對基于CmeR的水楊酸細(xì)胞生物傳感器進(jìn)行了構(gòu)建和表征。除了水楊酸、膽汁鹽、膽酸鹽和?;悄懰猁}外,還鑒定了多種芳香族和吲哚類誘導(dǎo)劑可作為大腸桿菌中CmeR的新配體。此前酪醇、色氨酸和酪胺都沒有作為aTF調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)劑。 值得一提的是,這種多配體特異性在同一途徑中會導(dǎo)致不同分子可能存在顯著的串聯(lián)干擾,在代謝工程應(yīng)用中直接利用CmeR會受到特異性的限制。但是利用這一特性,可以將CmeR這種多配體特異性使其成為檢測分子的工具,以及定向進(jìn)化的良好靶點(diǎn)。同時,鑒于CmeR配體的雜亂性,也可以研究其他芳香族和吲哚類分子在誘導(dǎo)空腸彎曲菌抗生素抗性中是否起作用。

論文鏈接: https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00063

審核編輯 :李倩

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原文標(biāo)題:轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器系統(tǒng),助力合成生物學(xué)應(yīng)用

文章出處:【微信號:Micro-Fluidics,微信公眾號:微流控】歡迎添加關(guān)注!文章轉(zhuǎn)載請注明出處。

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