一種基于深度學(xué)習(xí)的超分辨熒光顯微鏡論文

細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)離不開(kāi)內(nèi)部多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精確分工和協(xié)同合作，洞悉細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器/蛋白分子的精密運(yùn)轉(zhuǎn)是一項(xiàng)重要的生命科學(xué)研究需求，為揭示發(fā)育、疾病等浩瀚生命現(xiàn)象的微觀機(jī)制提供重要參考。借助熒光顯微成像技術(shù)，人們得以實(shí)現(xiàn)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特異性觀測(cè)，但因光學(xué)衍射極限的存在，成像的分辨率被限制在200納米左右，這大大阻礙了對(duì)其精細(xì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探究。超分辨熒光顯微成像技術(shù)的出現(xiàn)，使清晰觀測(cè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成為可能，但目前主流的超分辨熒光顯微鏡需通過(guò)多組圖像測(cè)量來(lái)突破光學(xué)衍射極限，伴隨著顯著降低的時(shí)間分辨率和劇增的光毒性。對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行低侵入性、高時(shí)空分辨率的精細(xì)觀測(cè)目前依然存在巨大的挑戰(zhàn)。

針對(duì)上述問(wèn)題，華中科技大學(xué)費(fèi)鵬教授課題組聯(lián)合武漢光電國(guó)家研究中心張玉慧教授課題組于2022年3月12日在Nature Methods在線發(fā)表題為Isotropic super-resolution light-sheet microscopy of dynamic intracellular structures at subsecond timescales的研究論文。文章提出了一種基于深度學(xué)習(xí)的超分辨熒光顯微鏡，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的精細(xì)動(dòng)態(tài)和相互作用進(jìn)行快速、三維、長(zhǎng)時(shí)程地觀測(cè)。

圖1 IDDR-SPIM成像技術(shù)的原理。a. 經(jīng)典Lattice光片、Field synthesis光片和本文雙環(huán)光片產(chǎn)生原理和效果的對(duì)比；b. 分而治之-協(xié)同優(yōu)化的漸進(jìn)式深度學(xué)習(xí)超分辨重建算法

研究在硬件上提出一種基于雙環(huán)掩膜（Double-Ring, DR）調(diào)控的選擇性光片照明方法（DR-SPIM），利用多級(jí)調(diào)制光的衍射顯著抑制光片旁瓣的同時(shí)產(chǎn)生厚度僅為450納米的超薄、靜態(tài)、消色差光片，提供高軸向分辨率的原始三維圖像并大幅度降低成像對(duì)活細(xì)胞的光毒性（圖1a）。圖像處理上，針對(duì)原始圖像中噪聲，衍射極限等多因素耦合造成的復(fù)雜降質(zhì)，研究者們進(jìn)一步提出各向同性、分而治之（Isotropic Divide-stage-to-process, ID）的計(jì)算重建新思路，構(gòu)建了多段級(jí)聯(lián)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，先利用局部多級(jí)先驗(yàn)知識(shí)的分段訓(xùn)練精確模擬成像物理過(guò)程，再通過(guò)多種損失函數(shù)的聯(lián)合優(yōu)化對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體約束，將光學(xué)成像中固有的噪聲、光學(xué)模糊、降采樣、非均一性等降質(zhì)問(wèn)題聯(lián)合求解，大幅度提升了算法在應(yīng)對(duì)低信噪比-低分辨率圖像時(shí)的增強(qiáng)性和精確性。最終基于單組帶噪、衍射受限的光片圖像即實(shí)時(shí)重建出高信噪比的超分辨圖像。（圖1b）。

光學(xué)和算法的軟硬聯(lián)合（IDDR-SPIM），克服了超分辨成像中時(shí)間和空間分辨率的相互妥協(xié)，無(wú)損速度地打破衍射極限，將活細(xì)胞三維成像空間分辨率提升到各向同性100納米的同時(shí)實(shí)現(xiàn)視頻速度的高時(shí)間分辨率。

圖2 五維（時(shí)間+三維空間+光譜）活細(xì)胞超分辨成像揭示線粒體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體/Drp1寡聚體的三維動(dòng)態(tài)相互作用

研究人員進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了GFP標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和RFP標(biāo)記線粒體結(jié)構(gòu)的同步-三維-動(dòng)態(tài)超分辨成像，捕捉到了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)控線粒體分裂的精細(xì)三維動(dòng)態(tài)過(guò)程，并基于高時(shí)空分辨率的數(shù)據(jù)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的三維相互作用進(jìn)行定量分析（圖2a, b）。而得益于IDDR-SPIM成像極低的光漂白率，研究人員還對(duì)Drp1寡聚體調(diào)控線粒體分裂或分支的過(guò)程進(jìn)行了持續(xù)觀測(cè)，并分類(lèi)表征了線粒體附著蛋白和游離蛋白在運(yùn)動(dòng)軌跡和速度上的不同（圖2c-e）。由于蛋白寡聚體較細(xì)胞器結(jié)構(gòu)體積更小，包含熒光分子更少，且在三維空間均存在運(yùn)動(dòng)，使用傳統(tǒng)的超分辨顯微鏡均難以捕捉，更難以完成長(zhǎng)時(shí)間觀察。

簡(jiǎn)言之，該研究提出了一種新的光片超分辨顯微成像策略，通過(guò)多級(jí)衍射調(diào)控的光片照明成像技術(shù)聯(lián)合分而治之的深度學(xué)習(xí)單圖超分辨算法，大幅突破現(xiàn)有三維超分辨成像的時(shí)空分辨率極限，為快速、三維、長(zhǎng)時(shí)程地觀測(cè)活細(xì)胞的精細(xì)動(dòng)態(tài)和相互作用提供了強(qiáng)有力的新工具。

費(fèi)鵬教授和張玉慧教授為本文共同通訊作者。費(fèi)鵬課題組博士生趙宇軒、周瑤，張玉慧教授課題組博士后張朦、博士生張文婷為論文共同第一作者。本研究在基金委重大研究計(jì)劃培育項(xiàng)目、基金委面上項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、基金委重大儀器研制項(xiàng)目、武漢光電國(guó)家研究中心WNLO創(chuàng)新基金的資助下開(kāi)展和完成。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41592-022-01395-5

審核編輯 ：李倩