北航利用基于微孔陣列的納米芯片解析肺癌細胞基因突變

特定基因突變可能會導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生特殊行為，例如超強耐藥性等。在活細胞內(nèi)、單細胞水平上探索基因突變與活細胞行為相關(guān)性能夠為臨床治療提供更加精準可靠的參考。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近日，北京航空航天大學常凌乾課題組在著名期刊Nano Letters上發(fā)表了一篇名為“Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior”的研究論文，并被選為當期的內(nèi)封面文章。該課題組開發(fā)了一種新型活細胞陣列研究平臺，通過納米電遞送技術(shù)將一種可原位信號放大的Domino熒光探針高效地遞送至活細胞內(nèi)，在單細胞水平檢測細胞內(nèi)基因突變。同時，基于微孔陣列的納米芯片具備細胞尋址的功能，可實現(xiàn)腫瘤細胞耐藥性的原位分析（圖1）。在研究臨床肺癌細胞樣本時發(fā)現(xiàn)，肺癌某些基因突變細胞比例與細胞對靶向藥敏感程度呈現(xiàn)正相關(guān)性。此平臺為單細胞分析、胞內(nèi)基因檢測提供了一種通用方法，在指導(dǎo)臨床精準治療方面具有較大的應(yīng)用潛力。

圖1 單細胞分析納米平臺原理示意圖。（a）基于微孔陣列的納米芯片在單個活細胞中檢測靶標RNA的原理。（b）Domino探針與靶標RNA結(jié)合前（OFF）后（ON）的構(gòu)象變化示意圖。（c）納米芯片用于將Domino探針遞送到活細胞中，并提供每個細胞的位置信息。（d）芯片分層裝配示意圖。

EGFR突變在肺癌基因突變中存在率最高。盡管EGFR靶向藥物可有效延長患者存活期，但腫瘤細胞易產(chǎn)生耐藥性，造成靶向藥物失效。預(yù)測患者是否存在EGFR突變，并推斷其腫瘤細胞對靶向藥物的耐藥性，在提高肺癌治療效果中起著關(guān)鍵作用。作者設(shè)計了一種名為“Domino”的DNA探針。此探針利用堿基互補配對原則，通過將成對的發(fā)夾DNA序列組裝形成緊密的螺旋鏈。與傳統(tǒng)的分子信標相比，Domino探針被靶標RNA識別的反應(yīng)速度加快了4倍，熒光信號增強了10倍。為遞送此探針，該論文作者開發(fā)了一種納米孔電遞送芯片，將Domino探針遞送到位于可尋址微孔中的數(shù)百萬個的肺癌細胞中，實現(xiàn)細胞內(nèi)的EGFR基因突變檢測（圖2）。

圖2 納米平臺檢測細胞內(nèi)的基因突變。（a）微孔陣列靶向L858R突變的Domino探針檢測H1975細胞（EGFR L858R突變）。比例尺：50 μm。（b）納米平臺檢測肺癌細胞H1975（L858R突變），HCC827（19外顯子缺失突變）和A549（野生型）EGFR L858R和19外顯子缺失突變的熒光圖。比例尺：10 μm。（c），（d）和（e）納米平臺檢測肺癌細胞H1975（c），HCC827（d）和A549（e）EGFR L858R和19外顯子缺失突變的流式結(jié)果。（f）采用流式細胞儀檢測的H1975，HCC827和A549細胞的突變細胞陽性率。（g）統(tǒng)計微孔陣列上突變細胞的陽性率。（h）SLCA納米平臺針對H1975，HCC827和A549細胞的加載效率，遞送效率和細胞活率。

該論文作者利用該平臺研究了肺癌患者臨床樣品中單個活細胞的基因突變，揭示了EGFR突變（21外顯子L858R和19外顯子E746-A750缺失突變）與相應(yīng)的靶向藥物耐受性之間存在明顯的正相關(guān)性（圖3）。該工作中提出的納米平臺實現(xiàn)了原位細胞培養(yǎng)、活細胞內(nèi)基因探測以及時空可控的細胞行為分析。

圖3 原代腫瘤細胞樣品中EGFR RNA突變檢測和耐藥性分析。（a）納米平臺檢測患者L1原代腫瘤細胞中EGFR L858R突變RNA的熒光圖像。比例尺：100 μm。（b）和（c）采用納米平臺從具有EGFR L858R突變（b）或19外顯子缺失突變（c）的原代腫瘤細胞樣品中檢測到的突變細胞陽性率。（d）和（e）分別對EGFR L858R突變（d）或19外顯子缺失突變（e）的原代腫瘤細胞樣品進行單細胞基因分析的qPCR結(jié)果。（f）和（g）EGFR突變靶向藥物厄洛替尼和吉非替尼對EGFR L858R突變（f）或19外顯子缺失突變（g）的原代腫瘤細胞的抑制作用。

該論文第一/通訊單位為北航生物醫(yī)學工程高精尖創(chuàng)新中心和生物醫(yī)學工程學院。第一作者是董再再博士。北京大學附屬腫瘤醫(yī)院吳楠教授和首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院薛新穎教授為共同通訊作者。

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