多光子顯微鏡成像計(jì)數(shù)：無標(biāo)記成像在發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用

光學(xué)成像可用于發(fā)育生物學(xué)，從而了解生物體的形成、揭示組織再生機(jī)制、認(rèn)識并管理先天性缺陷和胚胎衰竭等。其中最受關(guān)注的兩個問題：一是心臟在早期發(fā)育中會發(fā)生劇烈的形態(tài)變化，其潛在功能和生物力學(xué)方面仍有待研究；二是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常會導(dǎo)致先天性的疾病，所以需要從動力學(xué)、功能和生物力學(xué)等方面對大腦發(fā)育過程進(jìn)行了解。

許多光學(xué)顯微鏡都依靠使用熒光標(biāo)記物來對特定分子或物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記然后成像。但是熒光標(biāo)記有標(biāo)記不均勻、光漂白、熒光劑干擾細(xì)胞功能、熒光劑無法標(biāo)記小分子等問題。所以，無標(biāo)記成像對于發(fā)育生物學(xué)十分重要。

表1列出了多種應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)的無標(biāo)記成像：OCT為光學(xué)相干層析成像，OCM為光學(xué)相干顯微鏡，RM為拉曼顯微鏡，BM為布里淵顯微鏡，SHGM為二次諧波顯微鏡，THGM為三次諧波顯微鏡，OPT為光學(xué)投影層析成像，PAT為光聲層析成像，PACT為光聲計(jì)算機(jī)斷層掃描，PAM為光聲顯微鏡，QPI為定量相位成像。

表1 應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)的無標(biāo)記成像 ［1］OCT是一種基于低相干性干涉測量法的光學(xué)成像技術(shù)， 主要應(yīng)用于組織結(jié)構(gòu)、脈管系統(tǒng)、血液循環(huán)和生物力學(xué)的成像。其分辨率1－15 um，成像深度在1－2 mm量級，具有非侵入式、無預(yù)處理、快速成像、實(shí)時3D建模評估等優(yōu)點(diǎn)。OCT可分為時域OCT和頻域OCT（圖1）。時域OCT利用光程匹配的組織反射光與參考光的干涉信號成像，因此需要調(diào)節(jié)參考鏡的位置來掃描不同深度的組織信息。頻域OCT的參考鏡是固定的，僅通過測量組織反射光和參考光疊加后的光譜并作傅里葉變換，即可獲得與時域OCT相同的結(jié)果。相較于時域OCT，頻域OCT的靈敏度和成像速度均大幅提升。

圖1． 時域OCT與頻域OCT的原理示意圖 ［2］OCM是OCT和共聚焦顯微鏡相結(jié)合的產(chǎn)物（圖2）， 主要應(yīng)用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織結(jié)構(gòu)的成像。相較OCT，OCM的對比度來源更豐富，空間分辨率也更高，3D分辨率達(dá)到1－2 ？m的同時可保持約0．5 mm的成像深度。OCM常用于植入前發(fā)育的胚胎成像。鑒于OCM與OCT相同的對比機(jī)制，也可用于功能性O(shè)CM成像，例如血管造影。

圖2． 一種OCM的示意圖 ［3］RM主要應(yīng)用于生物分子的成像， 對于胚胎成像，RM可提供非常豐富的分子信息。例如，在植入前階段，脂質(zhì)在胚胎發(fā)育中起重要的代謝作用。RM可以對脂質(zhì)液滴的數(shù)量和空間分布進(jìn)行長期的評估，從而進(jìn)一步表征脂質(zhì)在胚胎發(fā)育中的功能。BM是一種基于探測布里淵散射的非線性成像方法， 主要應(yīng)用于生物力學(xué)成像。布里淵散射是光在介質(zhì)中受到各種元激發(fā)的非彈性散射，其頻率變化表征了元激發(fā)的能量。與拉曼散射不同的是，布里淵散射涉及的是能量較小的元激發(fā)，如聲學(xué)聲子和磁振子等。光波與千兆赫茲頻率的聲波（聲子）相互作用，所產(chǎn)生的光頻移反映了樣品的高頻彈性模量。因此，BM可用于測量材料的彈性性能，對于探測胚胎的韌性（剛度）具有很高的價值。SHG過程對有序的非中心對稱分子結(jié)構(gòu)具有高度特異性，因此可為某些細(xì)胞和組織成分（如膠原蛋白、微管和肌球蛋白）提供清晰的成像對比度，這對胚胎評估非常有用。例如，SHG顯微鏡可用于對果蠅胚胎的肌肉結(jié)構(gòu)和氣管系統(tǒng)成像。以及用于小鼠胚胎心臟中纖維結(jié)構(gòu)的3D成像，顯示了心臟纖維含量和組織的時間變化和空間異質(zhì)性（圖3）。

圖3． 胚胎第8．5天時小鼠胚胎心臟中的纖維結(jié)構(gòu)的SHG成像。（A） 整個心臟的SHG圖像的3D重建，包括原始心房、原始心室和流出道；（B、C） （A）中所示位置的橫截面圖；（D－F） （A）中所示位置：（D） 流出道和（E、F） 心室的放大圖像；（F）在心臟表面以下15米處。［1］THG通常發(fā)生在折射率失配的結(jié)構(gòu)界面處。對于胚胎成像，THG顯微鏡主要用于提供高分辨率的結(jié)構(gòu)信息。另外，由于THG信號能夠很好地描繪細(xì)胞膜，THG顯微鏡還可用于細(xì)胞追蹤，包括探測秀麗隱桿線蟲胚胎的早期細(xì)胞分裂以及測量青蛙胚胎的血流速度。光學(xué)投影層析成像（OPT）與CT原理相同（圖4）。首先得到樣品在不同方向上的投影數(shù)據(jù)，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)重建得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。OPT成像模式有兩種：透射OPT（或明場OPT），其對比度來自樣品的光吸收；發(fā)射OPT，其對比度來源于樣品的自發(fā)熒光信號或熒光染色劑信號?；跓晒獾腛PT是研究整個胚胎中3D基因表達(dá)模式的重要方法，基于無標(biāo)記吸收的OPT則主要用于了解器官的形態(tài)，用于胚胎的定量形態(tài)成像。無標(biāo)記OPT也被用于早期人類胚胎的成像，著眼于大腦發(fā)展，表明神經(jīng)系統(tǒng)中的許多結(jié)構(gòu)都可以在3D模式下被識別。

圖4． 計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（CT）原理示意圖。［4］PAT的原理為光聲效應(yīng)：當(dāng)激光照射組織時，組織會吸收激光的能量，溫度上升并膨脹。當(dāng)目標(biāo)組織被周期性強(qiáng)度調(diào)制的激光照射時，則會發(fā)生周期性的熱脹冷縮，從而發(fā)出超聲波。光聲成像檢測的便是組織受光激發(fā)產(chǎn)生的超聲信號。在成像過程中，組織受激光照射熱脹冷縮，在組織內(nèi)部形成了一個初始聲場。超聲換能器在組織周圍接收傳播出來的聲波，利用聲波信號和相應(yīng)的重建算法，反向重建出初始聲場，從而得到組織的激光吸收率分布圖像（圖5）。而且，由于樣品內(nèi)部不同深度位置的聲信號到達(dá)樣品表面的超聲信號存在時間差異，利用時間分辨技術(shù)可獲得不同層析面的光聲信號，由此可重建3D的光聲圖像。

圖5． PAT的原理示意圖。［5］PAT不僅是非侵入式，無需標(biāo)記的成像方法，還結(jié)合了光學(xué)高對比度和聲學(xué)高分辨率的優(yōu)勢。通過施加不同的光波長，PAT還有極其豐富的對比度來源，如血紅蛋白、黑色素、DNA ／ RNA、脂質(zhì)和水。利用氧合和脫氧血紅蛋白的不同吸收光譜，PAT不僅可以進(jìn)行脈管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)成像和血液循環(huán)功能成像，還可以進(jìn)行氧飽和度和耗氧代謝成像。相襯顯微鏡技術(shù)用于弱散射或吸收光的生物樣品（例如植入前的胚胎）?；谕干涿鲌鲲@微鏡，通過相干光干涉來探測相襯，從而分辨出相對透明的細(xì)胞成分。定量相位成像（QPI）作為一種先進(jìn)的相襯顯微鏡技術(shù)已被用于不同類型的細(xì)胞，并在了解神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織、同時評估細(xì)胞運(yùn)動和生長以及測量細(xì)胞力學(xué)方面得到了應(yīng)用。以上這些用于發(fā)育生物學(xué)的無標(biāo)記成像模式之間存在相似的成像功能，接著比較一下它們針對特定應(yīng)用的差異：OCT和OPT均可用于組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)的成像，且都有微米水平的分辨率。其中OPT具有更高的成像深度，能夠覆蓋整個大尺寸胚胎，而OCT由于成像深度的限制，僅限于探測靠近表面的組織結(jié)構(gòu)。不過，OCT可用于活體動態(tài)成像，OPT則不適合。對于血管成像，PAT直接測量血紅蛋白的光吸收，可以從組織內(nèi)部深處進(jìn)行體積重建，而OCT通過功能性血流分析只能以相對有限的深度實(shí)現(xiàn)脈管系統(tǒng)成像。但OCT的優(yōu)勢是能夠?qū)γ}管系統(tǒng)和高分辨率組織結(jié)構(gòu)同時成像，這點(diǎn)PAT難以實(shí)現(xiàn)。對于胚胎組織的生物力學(xué)成像，基于OCT的彈性成像需要適當(dāng)?shù)呢?fù)荷（loading）才能傳遞到目標(biāo)位置。對于心臟，主動收縮力是自然負(fù)荷，使OCT能夠評估心臟壁的應(yīng)變和應(yīng)變率。但是，對于其他器官或組織，OCT的生物力學(xué)成像可能會因缺乏合適的負(fù)荷（suitable loading methods）而受到限制。與OCT不同，BM進(jìn)行生物力學(xué)成像，不需要外部負(fù)荷（loading），理論上能夠應(yīng)用于任何可收集布里淵散射光的胚胎組織。發(fā)育過程是非常多樣的，單一類型的成像只能提供有限的信息。以上部分成像方式雖存在相似的功能但各有優(yōu)勢，所以將不同的成像方式結(jié)合在一起的多模態(tài)成像方法前景廣闊。往期精彩：

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參考文獻(xiàn)： ［1］ SHANG WANG， IRINA V． LARINA， KIRILL V． LARIN． Label－free optical imaging in developmental biology ［Invited］ ［J］． Biomedical Optics Express． 2020， 11（4）： 2017～2040． ［2］ Drexler W， et al． Optical coherence tomography today： speed， contrast， and multimodality． J Biomed Opt． 2014；19（7）：071412． ［3］ K． Karnowski， A． Ajduk， B． Wieloch， S． Tamborski， K． Krawiec， M． Wojtkowski， and M． Szkulmowski， “Optical coherence microscopy as a novel， non－invasive method for the 4D live imaging of early mammalian embryos，” Sci． Rep． 7（1）， 4165 （2017）． ［4］ Pahlm O， Wagner GS： Multimodal Cardiovascular Imaging： Principles and Clinical Applications： www．accessmedicine．com ［5］ Wikipedia． https：／／en．wikipedia．org／wiki／Photoacoustic＿imaging．