多光子顯微鏡成像技術(shù)：大視場(chǎng)多區(qū)域腦成像技術(shù)

為了了解神經(jīng)回路的功能以及神經(jīng)元之間的相互作用,需要對(duì)不同區(qū)域的大量神經(jīng)元進(jìn)行活體成像,我們這里介紹兩種顯微鏡技術(shù),分別針對(duì)大視場(chǎng)多區(qū)域成像和自由活動(dòng)小鼠的活體成像。

從圖1可以看出用于視覺處理的神經(jīng)元分布在直徑約3毫米的區(qū)域——小鼠初級(jí)視覺皮層和多個(gè)較高級(jí)的視覺區(qū)域。當(dāng)前的商用雙光子顯微鏡系統(tǒng)通常提供約0．5mm的視場(chǎng)(FOV),僅能對(duì)一小部分區(qū)域的神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行成像(圖1A), 而且它們僅能使用單束激光對(duì)單個(gè)區(qū)域進(jìn)行成像。所以想要詳細(xì)了解小鼠視覺皮層區(qū)域神經(jīng)元的活動(dòng),需要開發(fā)視場(chǎng)大于3mm(圖1B),并且能夠同時(shí)進(jìn)行多區(qū)域成像的雙光子顯微鏡(圖1C)。

圖1 小鼠大腦的視覺區(qū)域[1]

文獻(xiàn)[1]開發(fā)了大視場(chǎng)、雙路徑掃描的雙光子顯微鏡系統(tǒng)(DIESEL2p),FOV大于5mm,兩束獨(dú)立的激光同時(shí)在兩個(gè)不同的區(qū)域采集圖像。圖2是DIESEL2p裝置圖,光源是鈦寶石激光器(80MHz、910nm),激光首先通過單棱鏡進(jìn)行預(yù)啁啾,在分開兩條路徑之前,經(jīng)過一個(gè)自適應(yīng)光學(xué)模塊,包括兩個(gè)變形鏡,用來動(dòng)態(tài)校正一些殘留的光學(xué)像差。

接著激光被偏振分束器分向兩條路徑;在路徑2中,通過延時(shí)光路將路徑2的激光束相較路徑1延遲6．25納秒,來建立時(shí)分復(fù)用;兩條光路都包括一個(gè)x共振型振鏡,一個(gè)x檢流計(jì)振鏡,一個(gè)y檢流計(jì)振鏡和光繼電器,每條掃描光路都可以獨(dú)立于另一條掃描光路進(jìn)行任意可變的光柵掃描。在兩條掃描光路之后,兩個(gè)分離的光束再通過偏振分束器合并。

圖2 DIESEL2p裝置[1]

該課題組展示了DIESEL2p系統(tǒng)的兩個(gè)主要的功能:大視場(chǎng)成像和多區(qū)域成像。圖3為DIESEL2p系統(tǒng)對(duì)小鼠的大腦組織在5毫米乘5毫米視場(chǎng)下進(jìn)行成像,視場(chǎng)達(dá)到5毫米乘5毫米,同時(shí)保持神經(jīng)元尺度的分辨率。

圖3 小鼠大腦組織的大視場(chǎng)成像[1]

圖4為利用DIESEL2p進(jìn)行同步雙區(qū)域成像的結(jié)果。兩條光路同時(shí)進(jìn)入皮膚不同區(qū)域,均覆蓋1．5毫米乘5毫米的視場(chǎng),且均設(shè)置每秒3．85幀的成像速率。圖中可以清晰分辨每個(gè)神經(jīng)元通過的兩種路徑以及神經(jīng)元的活動(dòng)。

圖4 小鼠大腦組織的同步多區(qū)域成像[1]

DIESEL2p不僅可以獨(dú)立地進(jìn)行雙路徑成像,而且可以以不同的方式完成它們,比如路徑1進(jìn)行大面積、低速率成像,而路徑2進(jìn)行小面積、高速率的成像。系統(tǒng)中的兩條路徑也可以重疊,路徑1的掃描面積較大,而路徑2的僅對(duì)路徑1的子區(qū)域進(jìn)行成像。

該系統(tǒng)還可以通過重新定位兩個(gè)或多個(gè)子區(qū)域之間的路徑增加成像的區(qū)域,例如,路徑1可以在兩個(gè)單獨(dú)的區(qū)域之間交替,而路徑2可以在另外兩個(gè)單獨(dú)的區(qū)域之間交替,因此可以對(duì)四個(gè)分開的區(qū)域進(jìn)行成像。最后,該系統(tǒng)不僅可以對(duì)路徑進(jìn)行光柵掃描,還可以進(jìn)行隨機(jī)訪問成像。如圖5,路徑1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)光柵掃描,路徑2可以在感興趣的區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)訪問成像。

圖5 小鼠大腦組織的同步多區(qū)域成像[1]

文獻(xiàn)[2]提出了一種寬場(chǎng)結(jié)構(gòu)照明顯微鏡,它通過一個(gè)光纖耦合的顯微鏡頭對(duì)自由活動(dòng)的小鼠的腦組織神經(jīng)元進(jìn)行成像。為了了解大量神經(jīng)元的活動(dòng),在對(duì)小鼠進(jìn)行活體成像時(shí),當(dāng)前的熒光顯微鏡技術(shù)對(duì)小鼠頭部進(jìn)行固定會(huì)阻止小鼠的部分自然行為,而在成像過程中,使清醒的小鼠減少限制自由活動(dòng),對(duì)理解其行為至關(guān)重要。所以需要制造緊湊的小型成像系統(tǒng),小鼠頭部配有微型顯微鏡,可進(jìn)行實(shí)時(shí)成像,通過減輕小鼠頭部固定的負(fù)擔(dān),它承受的壓力較小,就可以自由活動(dòng)。該工作提出了一種寬場(chǎng)結(jié)構(gòu)照明顯微鏡,通過一個(gè)微型、小質(zhì)量的光纖耦合的顯微鏡頭進(jìn)行成像。

根據(jù)阿貝成像原理,許多光學(xué)成像系統(tǒng)是一個(gè)低通濾波器,物平面包含從低頻到高頻的信息,透鏡口徑會(huì)限制高頻信息通過,只允許一定的低頻通過,因此丟失了高頻信息會(huì)使成像所得圖像的細(xì)節(jié)變模糊,降低分辨率。對(duì)于三維成像來說,寬場(chǎng)照明時(shí)得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,同時(shí)還包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息干擾,常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。

三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率、獲得層析圖像,是因?yàn)槔锰囟ńY(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息,當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時(shí),只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制,超出這一區(qū)域,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰?也就是只有焦面附近的有限區(qū)域具有相對(duì)完整的頻譜信息,離焦后,高頻信息迅速衰減,所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像,重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)裝置如圖6所示,非相干LED光源波長(zhǎng)為470 nm,數(shù)字微鏡器件(DMD)生成結(jié)構(gòu)照明條紋,控制相干光纖束(CFB)入射面的照明空間模式。然后,空間圖案通過光纖束再通過光纖耦合顯微鏡(FCM)聚焦到樣本上,左下圖即是穿過光纖束的結(jié)構(gòu)照明條紋圖案示例。樣品發(fā)出的熒光通過CFB收集,經(jīng)過二向色鏡和濾波片最終成像到CMOS相機(jī)上。

圖6 實(shí)驗(yàn)裝置[2]

微型光纖耦合顯微鏡(FCM)的具體結(jié)構(gòu)如圖7。FCM中集成了一個(gè)微型電潤(rùn)濕可調(diào)透鏡,用于深度掃描,通過施加特定的電壓,電濕潤(rùn)透鏡內(nèi)部?jī)煞N液體之間的相互作用會(huì)改變激發(fā)的焦點(diǎn)。并且由于電潤(rùn)濕透鏡內(nèi)部?jī)煞N液體的密度相似,不會(huì)受到運(yùn)動(dòng)和振動(dòng)的影響,因此非常適合用于清醒的動(dòng)物。FCM在組織中的視場(chǎng)為215微米,軸向總掃描范圍為250微米。

圖7 光纖耦合顯微鏡(FCM)[2]

為了驗(yàn)證該成像系統(tǒng)的功能,該課題組對(duì)小鼠的固定腦切片進(jìn)行了深度成像(圖8),使用FCM分別獲得了寬場(chǎng)和結(jié)構(gòu)照明下海馬神經(jīng)元的圖像,樣品處的照明圖案的空間頻率為65．1 mm-1。與寬場(chǎng)相比,重建的SIM圖像有相同或更好的信噪比。通過調(diào)節(jié)施加到電潤(rùn)濕透鏡上的電壓在厚組織中進(jìn)行了深度掃描成像,在不同軸向焦平面上的圖像重建,可以產(chǎn)生4．9 ?m的光學(xué)切片?？偟膩碚f,該課題組發(fā)展了一種寬場(chǎng)結(jié)構(gòu)照明顯微鏡它通過一個(gè)微型、小質(zhì)量的光纖耦合顯微鏡頭對(duì)自由移動(dòng)的小鼠進(jìn)行深腦體積成像,并且光纖耦合顯微鏡內(nèi)部裝有電潤(rùn)濕可調(diào)透鏡,可以實(shí)現(xiàn)無機(jī)械軸向掃描。

審核編輯：符乾江