多光子顯微鏡成像技術(shù)：偏振分辨倍頻顯微鏡及其圖像處理

在非線性光學(xué)顯微鏡中，二倍頻（SHG）成像通常用于觀測(cè)內(nèi)源性纖維狀結(jié)構(gòu)，且SHG的強(qiáng)度很大程度上取決于入射光束的偏振方向與目標(biāo)分子取向軸之間的相對(duì)角度。因此，基于偏振的SHG成像（P－SHG），可通過(guò)分析SHG信號(hào)強(qiáng)度與入射光束的偏振態(tài)之間的函數(shù)關(guān)系，來(lái)獲得目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)信息。其現(xiàn)在已用作醫(yī)學(xué)和生物學(xué)分析的重要工具。

簡(jiǎn)單的SHG圖像可以通過(guò)傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光顯微鏡（TPM）獲得。大多數(shù)TPM系統(tǒng)仍采用基于運(yùn)動(dòng)鏡面的單束掃描方法，其時(shí)間分辨率取決于鏡面的物理移動(dòng)速度。為了實(shí)現(xiàn)更高速的成像，TPM系統(tǒng)還可以采用多束掃描的方法（圖1A），其中之一便是利用轉(zhuǎn)盤掃描單元。該單元由共軸的微透鏡轉(zhuǎn)盤和針孔轉(zhuǎn)盤構(gòu)成，兩個(gè)轉(zhuǎn)盤上的微透鏡和針孔一一對(duì)應(yīng)。

激光在通過(guò)微透鏡轉(zhuǎn)盤時(shí)，波前會(huì)覆蓋多個(gè)微透鏡，不同微透鏡將波前各部分聚焦到不同的位置，并穿過(guò)對(duì)應(yīng)的針孔，形成多個(gè)微光束。這些微光束打到樣品上，可同時(shí)激發(fā)多個(gè)信號(hào)。這些信號(hào)沿顯微鏡系統(tǒng)返回并再次穿過(guò)針孔，最后被兩個(gè)轉(zhuǎn)盤之間的二向色鏡反射到檢測(cè)裝置中。然而，常規(guī)使用的鎖模鈦寶石激光器作為光源能量不足，限制了激發(fā)光束的數(shù)量，導(dǎo)致使用轉(zhuǎn)盤掃描單元的TPM （TPM－SD） 的有效視場(chǎng) （FOV） 很小。

Ai Goto等人想通過(guò)TPM－SD系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高速的P－SHG成像，并保證大的FOV，故在TPM－SD系統(tǒng)中引入了峰值功率更高的基于Yb的激光光源。

圖1是他們開(kāi)發(fā)的TPM－SD系統(tǒng)示意圖。該系統(tǒng)光源為基于Yb的激光器，產(chǎn)生的飛秒脈沖中心波長(zhǎng)為1042 nm、平均功率4 W、脈寬300 fs，重復(fù)頻率10 MHz。系統(tǒng)首先通過(guò)半波片和格蘭激光偏振器來(lái)調(diào)節(jié)激光功率，接著通過(guò)擴(kuò)束器進(jìn)行擴(kuò)束，擴(kuò)束后的光束被引入到轉(zhuǎn)盤掃描單元中，接著從掃描單元出來(lái)的多個(gè)微光束通過(guò)水浸物鏡被聚焦在樣品的多個(gè)點(diǎn)上。為了調(diào)整光束在物鏡處的偏振態(tài)，激發(fā)光束的光路上放置了一個(gè)半波片和一個(gè)四分之一波片。

為了測(cè)量樣品上入射光束的偏振態(tài)，在物鏡后端放置了一個(gè)線性偏振膜。在這項(xiàng)研究中，他們使用了圓偏振光（圖1B；橢圓度0．95）和4種線偏振光束（圖1C－F；橢圓度0．2－0．3）。以FOV的水平軸為基準(zhǔn)，將橫向偏振角設(shè)置為0、45、90和135°。物鏡收集到的熒光或SHG光通過(guò)針孔轉(zhuǎn)盤，被二向色鏡反射至偏振分束器。偏振分束器將信號(hào)分離為一對(duì)偏振分辨信號(hào)，它們被放大倍數(shù)為×1．2的中繼透鏡分別聚焦在電子倍增CCD相機(jī)的不同方形檢測(cè)區(qū)域上，從而同時(shí)獲取一對(duì)矩形圖像。軸向掃描是通過(guò)壓電驅(qū)動(dòng)器實(shí)現(xiàn)的。

總之，該組通過(guò)TPM－SD系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了一種高速的偏振分辨成像方法。他們使用該系統(tǒng)對(duì)固定的小鼠皮膚樣品和骨骼肌樣品（離體）以及活體小鼠的骨骼肌進(jìn)行了成像，證明了該系統(tǒng)能以56 Hz的時(shí)間分辨率對(duì)體內(nèi)組織成像，獲取膠原纖維的結(jié)構(gòu)信息。

圖1 （A） TPM－SD系統(tǒng)；（B–F） 通過(guò)調(diào)整HWP和QWP的位置，改變?nèi)肷涔饷}沖在樣品上的偏振態(tài)。［1］

非線性成像技術(shù)的優(yōu)化，除了基于圖像獲取模式的優(yōu)化，還可以從先進(jìn)的圖像處理算法入手。發(fā)展圖像的實(shí)時(shí)分析工具，以幫助病理學(xué)家快速表征組織特性，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的病癥診斷，具有極大的推動(dòng)醫(yī)學(xué)發(fā)展的潛力。目前，用于自動(dòng)提取疾病特征的用戶獨(dú)立算法引起了越來(lái)越多的關(guān)注。2019年，Riccardo Scodellaro等人開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)P－SHG的圖像處理方法——μMAPPS（Microscopic Multiparametric Analysis by Phasor projection of Polarization－dependent SHG signal）。其原理是對(duì)每個(gè)像素的隨入射光偏振態(tài)變化的SHG信號(hào)（）進(jìn)行二維相量分析，從中分析出各像素對(duì)應(yīng)膠原蛋白纖維的平均取向角 （θF）和極化率各向異性參數(shù)（γ，極化率張量χ（2）的非對(duì)角線和對(duì)角線元素的比），并依此獲得組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中膠原蛋白的微結(jié)構(gòu)信息。

該組的最終目標(biāo)為無(wú)人員操作，全自動(dòng)化，基于μMAPPS算法的病理學(xué)診斷：通過(guò)區(qū)分不同組織中不同的膠原蛋白結(jié)構(gòu)，來(lái)區(qū)分正常組織和癌變組織。具體方法為，先通過(guò)μMAPPS重構(gòu)每個(gè)像素的和信息，接著，將整個(gè)圖像劃分為包含大量感興趣區(qū)域（ROI）的網(wǎng)格，對(duì)每個(gè)ROI的所有像素應(yīng)用聚類算法，將和類似的像素歸為一類（簇），至此，每個(gè)ROI的像素都被分為了數(shù)十個(gè)簇，然后，基于不同ROI中不同的分簇，定義一組參數(shù) （p參數(shù)：簇?cái)?shù)（NC），簇元素比（CER，每個(gè)簇與最大像素?cái)?shù)量的簇，所含像素?cái)?shù)量之比），和熵（S））， 以量化各ROI中膠原蛋白結(jié)構(gòu)的無(wú)序性。

最后，以所有ROI參數(shù)的平均值為基準(zhǔn)，將各ROI區(qū)分為正常組織或癌變組織，并對(duì)應(yīng)投影回原圖像中。圖2是基于熵值的腫瘤邊緣分割結(jié)果。該組通過(guò)研究CT26（結(jié)腸癌）和4T1（乳腺癌）兩種癌癥模型，測(cè)試了該方法自動(dòng)區(qū)分腫瘤和健康組織區(qū)域的準(zhǔn)確率，并證明熵是在同一組織類型內(nèi)，區(qū)分腫瘤與健康區(qū)域，判別腫瘤邊緣的最佳參數(shù)。

圖2 （A， B） 基于熵（S）的感興趣區(qū)域（ROI）的分析結(jié)果。每個(gè)150×150 ?m2的ROI（A， B）都按照?qǐng)D例進(jìn)行了顏色編碼，以表示CT26的癌變區(qū)域（A）和4T1的癌變區(qū)域（B），及其中檢索到的熵值。（C， D） 將ROI分析結(jié)果反投影到CT26 （C）和4T1 （D） 腫瘤模型的原圖像平面，并分割出癌變部分的圖像。紅色虛線表示腫瘤和正常組織的邊界。 ［2］

參考文獻(xiàn)

［1］ 2019． Ai Goto?， Kohei Otomo? and Tomomi Nemoto． Real－Time Polarization－Resolved Imaging of Living Tissues Based on Two－Photon Excitation Spinning－Disk Confocal Microscopy

［2］ 2019． Riccardo Scodellaro， Margaux Bouzin， Francesca Mingozzi， Laura D’Alfonso，F(xiàn)rancesca Granucci， Maddalena Collini， Giuseppe Chirico? and Laura Sironi?． Whole－Section Tumor Micro－Architecture Analysis by a Two－Dimensional Phasor－Based Approach Applied to Polarization－Dependent Second Harmonic Imaging