多光子顯微鏡成像技術(shù)：多光子顯微鏡的焦點(diǎn)深度擴(kuò)展方法

雙光子激光掃描顯微鏡結(jié)合鈣指示劑是活體神經(jīng)元信號探測的金標(biāo)準(zhǔn)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)元分布在三維空間中，監(jiān)測它們的活動(dòng)動(dòng)態(tài)需要一種能夠快速提高體積成像速率的方式。但是，使用光柵掃描多光子顯微鏡對大量圖像進(jìn)行成像，如果采用高數(shù)值孔徑（NA）的物鏡來獲得較高的橫向分辨率時(shí)，會導(dǎo)致較小的聚焦深度，為了獲得小聚焦深度下的體積成像，

必須通過一些手段進(jìn)行Z軸掃描，通過掃描每個(gè)焦平面來成像許多平面，這大大限制了成像速度。如果可以犧牲軸向圖像信息，通過擴(kuò)展焦深在一次橫向掃描中實(shí)現(xiàn)體積掃描，也就是體積信息被投影到單個(gè)2D圖像中，就可以大大提高成像速度，這被稱為擴(kuò)展焦深（EDF）成像，對于要求高時(shí)間分辨率的稀疏群體結(jié)構(gòu)成像（例如神經(jīng)元活動(dòng)的功能成像）特別有用。

顯微鏡的軸向和橫向分辨率均由物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定。高NA可使軸向和橫向分辨率以及所收集的光量最大化；較低的NA將產(chǎn)生較低的軸向分辨率，即更長的焦深，但同時(shí)會犧牲橫向分辨率和光收集效率。接下來要介紹的擴(kuò)展焦深的方法，能夠在保持高橫向分辨率和足夠通光量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)展焦深。

使用空間光調(diào)制器產(chǎn)生焦點(diǎn)細(xì)長的貝塞爾光束可以實(shí)現(xiàn)EDF成像，但空間光調(diào)制器體積大，很難與狹窄的顯微鏡空間兼容；相比之下，基于軸棱錐的貝塞爾模塊便宜且緊湊，但它只能產(chǎn)生固定深度的焦點(diǎn)，不適合用于需要焦深連續(xù)變化的各種實(shí)驗(yàn)。為了解決這個(gè)問題，2018年，RONGWEN LU等人展示了一種基于軸棱錐的貝塞爾模塊，只需要在該模塊中沿光軸平移一個(gè)透鏡，就可以連續(xù)調(diào)節(jié)貝塞爾焦點(diǎn)的軸向長度。

圖1（a）貝塞爾模塊裝置圖；（b）當(dāng)D分別為－12mm，0mm和12mm時(shí)實(shí)驗(yàn)測得點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)；（c）橫向半高全寬、（d）軸向半高全寬、（e）峰值信號和（f）物鏡后光功率隨L2位移D的變化關(guān)系

形成長度可變的貝塞爾焦點(diǎn)的模塊裝置如圖1a所示，入射的高斯光束經(jīng)過軸棱錐和透鏡L1之后被整形為環(huán)形光束，緊接著的環(huán)形光圈掩?？梢宰钃跤奢S棱錐缺陷引起的雜散光，從而塑造雙光子激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的軸向分布。之后光束被透鏡L2和L3投射到振鏡上，再通過透鏡L4和L5到達(dá)物鏡的后焦面。

這些設(shè)計(jì)與傳統(tǒng)的基于軸棱錐的模塊類似，不同之處在于通過沿光軸移動(dòng)L2或L3，可以連續(xù)調(diào)節(jié)貝塞爾焦點(diǎn)的軸向長度。圖1b顯示了D分別為－12mm，0mm和12mm時(shí)的軸向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，其軸向半高全寬分別為39?m，24?m和14?m。如圖1c－f，從左至右移動(dòng)透鏡L2可以連續(xù)改變橫向和軸向的半高全寬，也就是可以連續(xù)改變焦深，且基于矢量衍射理論的數(shù)值模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常吻合。圖2驗(yàn)證了不同尺寸的環(huán)形掩模對軸棱錐缺陷的校正作用，發(fā)現(xiàn)較薄的環(huán)形掩模能夠更好地優(yōu)化輸出貝塞爾光束的軸向強(qiáng)度分布，但同時(shí)也會導(dǎo)致更多的功率損耗。

圖2不同環(huán)形掩模得到輸出焦點(diǎn)的軸向強(qiáng)度分布。無掩模（紅色實(shí)線）；掩模1（藍(lán)色實(shí)線）；掩模2（黑色實(shí)線）；模擬結(jié)果（黑色虛線）

圖3 a，b：使用高斯光束的體成像結(jié)果；c－j：使用貝塞爾光束不同D值時(shí)的成像結(jié)果

該組分別使用高斯光束和貝塞爾光束對斑馬魚中腦和后腦的脊柱神經(jīng)元進(jìn)行成像（圖3），發(fā)現(xiàn)即使使用最短的貝賽爾焦點(diǎn)也能比使用高斯光束掃描更多的神經(jīng)元，并且可以提供和二維高斯掃描方式相當(dāng)?shù)臋M向分辨率。最后，該組對斑馬魚幼蟲脊髓投射神經(jīng)元進(jìn)行體積鈣成像（圖4），研究了參與逃避行為的斑馬魚的神經(jīng)元?jiǎng)討B(tài)過程，采用體積速率為50 Hz的貝塞爾光束監(jiān)測這些神經(jīng)元的活性，鑒定出其中的15個(gè)神經(jīng)元，這些神經(jīng)元表現(xiàn)出敲擊誘發(fā)的鈣瞬變。與高斯光束相比，使用貝塞爾光束時(shí)體積速率提高了26倍。

圖4斑馬魚幼蟲脊髓投射神經(jīng)元體區(qū)域的50 Hz鈣成像

除了以上提到的使用空間光調(diào)制器和軸棱錐來獲得貝塞爾光束的方法外，早年最簡單的方式是使用環(huán)形狹縫和傅里葉變換透鏡，透鏡會對經(jīng)過環(huán)縫的光場作傅里葉變化，在其后焦面處產(chǎn)生近似貝塞爾光束，但是使用一個(gè)簡單的環(huán)形孔擴(kuò)展焦深會導(dǎo)致光的大量損失，只有一小部分可用的光會通過環(huán)面?zhèn)鬏?，會影響成像?/p>

為了解決使用單個(gè)環(huán)擴(kuò)展焦深光通量不夠的問題， BINGYING CHEN等人利用超短脈沖相干長度短的特性，采用多環(huán)結(jié)構(gòu)的分束掩模，超快激光脈沖經(jīng)過時(shí)會被分束掩模分成不同的環(huán)形子束，每個(gè)子束都有時(shí)間延遲，也就是每個(gè)子束在不同的時(shí)間點(diǎn)在物鏡的焦平面上形成貝塞爾焦點(diǎn)。如果每個(gè)環(huán)引入的時(shí)間延遲大大超過了激光脈沖的持續(xù)時(shí)間，則子束將互不相干，產(chǎn)生的EDF焦點(diǎn)是所有單個(gè)貝塞爾焦點(diǎn)的非相干疊加，如圖5所示。

圖5 a：分束掩模結(jié)構(gòu)圖；b：分束掩模擴(kuò)展焦點(diǎn)深度的原理示意圖；c：模擬的不同環(huán)形光非相干疊加的結(jié)果（1－5表示由內(nèi)到外，EDF：深度擴(kuò)展后的焦點(diǎn)）

基于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的掩模參數(shù)，該組進(jìn)行了數(shù)值模擬，結(jié)果如圖6，最大NA為0．67時(shí)計(jì)算得到的橫向和軸向分辨率分別為550nm和15．98μm，比常規(guī)聚焦方式的軸向尺寸大4．96倍，而橫向半高全寬僅比常規(guī)聚焦方式大7％。

圖6 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的數(shù)值模擬結(jié)果

該組搭建的實(shí)驗(yàn)裝置如圖7所示，由鈦寶石激光器輸出的中心波長900nm，脈沖寬度140fs的超短脈沖通過普克爾盒進(jìn)行功率調(diào)節(jié)，經(jīng)過擴(kuò)束器后進(jìn)入掩模，掩模每層的厚度約為400μm，對脈沖提供的時(shí)間延遲為720fs，滿足非相干疊加的要求。之后光束經(jīng)過一系列透鏡和兩個(gè)振鏡被耦合至物鏡光瞳平面，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)展焦深成像。

圖7 實(shí)驗(yàn)裝置圖。1：普克爾盒，光隔離器；2，4，7，8，18：透鏡；3：圓孔；5：虹膜；6：分束掩模；9，12：振鏡；10，11：普羅素目鏡；13：掃描透鏡；14：管狀透鏡；15：二向色鏡；16：物鏡；17：濾波器；19：光電倍增管

對輸出光束的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)測量結(jié)果如圖8所示。對比有掩模和無掩模的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)發(fā)現(xiàn)，有掩模時(shí)的軸向半高全寬是無掩模情況下的5．8倍，橫向半高全寬增加15％。降低無掩模條件的NA使得軸向半高全寬和有掩模時(shí)一致，橫向半高全寬增加約1倍。上述結(jié)果說明該掩模能在略微犧牲橫向分辨率的條件下顯著提升焦點(diǎn)深度。為了驗(yàn)證分束掩模在神經(jīng)科學(xué)成像中的應(yīng)用潛力，該組還展示了固定小鼠腦樣本中GFP標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光成像。

圖8 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)測量結(jié)果。

總之，對于稀疏群體結(jié)構(gòu)，采用上述擴(kuò)展焦深成像的方法，可以在保持橫向分辨率和光通量的同時(shí)擴(kuò)展焦深，進(jìn)而大大提高成像速度，這在活體神經(jīng)元信號探測方面十分有潛力。

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