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熒光壽命顯微成像技術(shù)(FLIM)技術(shù)應(yīng)用綜述

工程師鄧生 ? 來源:《Light: Science & Application ? 作者::Hua(哈工大 博士 ? 2020-11-10 14:00 ? 次閱讀

在生物體中,細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞間質(zhì)及體液成分構(gòu)成了細(xì)胞生存的微環(huán)境。穩(wěn)定的微環(huán)境是保持細(xì)胞的正常增殖、分化、代謝以及其他功能活動(dòng)最為重要的條件,細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的信息傳遞也離不開其所處的環(huán)境。

此外,在一些疾病的治療中,藥物分子與病變組織分子間相互作用,也會(huì)改變其微環(huán)境,可通過研究細(xì)胞或組織的微環(huán)境來評(píng)價(jià)藥物治療效果。

因此,對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的高分辨率、高靈敏度探測(cè)成為了生物醫(yī)學(xué)的重要研究課題。

圖源:中科院長(zhǎng)春光機(jī)所,Light學(xué)術(shù)出版中心,新媒體工作組

光學(xué)顯微技術(shù)可以將微米甚至納米量級(jí)的微小物質(zhì)及結(jié)構(gòu)展現(xiàn)在我們面前,是我們打開微觀世界大門,觀察細(xì)胞組織和生物微環(huán)境的鑰匙。

若成像基于熒光發(fā)光團(tuán)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,則可稱之為熒光強(qiáng)度顯微技術(shù)。此類顯微技術(shù)通過顯微鏡的目鏡收集樣品各個(gè)位置的熒光強(qiáng)度,便可以得到生物組織的形貌,具有較髙成像空間分辨率,但受熒光團(tuán)濃度的影響,其測(cè)量精度和定量分析能力都不理想。

幸運(yùn)的是,在種類繁多的顯微技術(shù)中,熒光壽命顯微成像技術(shù)(FLIM)具有對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)信息和分子環(huán)境等進(jìn)行高分辨高精度測(cè)量的能力,因此其重要性日漸提升,被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)研究及臨床診斷等領(lǐng)域。

近期,美國莫格里奇研究所的Melissa C.Skala【?拓展鏈接】課題組在Journal of Biomedical Optics發(fā)表了題為“Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications”的綜述文章,詳細(xì)介紹了FLIM的發(fā)展,總結(jié)了時(shí)域、頻域兩類熒光壽命探測(cè)方案,考察了對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性測(cè)量的圖像算法,最后列舉了FLIM在生物醫(yī)學(xué)上的實(shí)際應(yīng)用。文章證實(shí)了FLIM在細(xì)胞微環(huán)境觀測(cè)領(lǐng)域的適用性,可被應(yīng)用于疾病控制和藥物療效的監(jiān)測(cè)。

熒光壽命

分子包含多個(gè)能態(tài)S0、S1、S2和三重態(tài)T1,每個(gè)能態(tài)都包含多個(gè)精細(xì)的能級(jí)。正常情況下,大部分電子處在最低能態(tài)即基態(tài)S0的最低能級(jí)上,當(dāng)分子被光束照射,會(huì)吸收光子能量,電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1或S2上,在S2能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時(shí)間,便會(huì)通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程躍遷到S1上,而S1能態(tài)上的電子亦會(huì)在極短時(shí)間內(nèi)躍遷到S1的最低能級(jí)上,而這些電子會(huì)存在一段時(shí)間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài),這個(gè)過程會(huì)釋放一個(gè)光子,即熒光。

此外,亦會(huì)有電子躍遷至三重態(tài)T1上,再由T1躍遷至基態(tài),但是該過程發(fā)生幾率較熒光輻射幾率而言可以被忽略。

熒光的特性包含有:熒光激發(fā)和發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、量子效率、熒光壽命等,其中,熒光壽命是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時(shí)間(納秒量級(jí))。

圖1 熒光分子能級(jí)結(jié)構(gòu)及躍遷示意圖

圖源:J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020)。 Fig.1

FLIM測(cè)量方案

分子的熒光壽命在幾納秒至幾百納秒之間,因此,測(cè)量熒光壽命需要極快響應(yīng)時(shí)間的探測(cè)器。如今主要存在兩類方案:一是時(shí)域測(cè)量,由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1,接著測(cè)量熒光的發(fā)射幾率隨時(shí)間的變化(圖2a,b)。典型的時(shí)域測(cè)量方法有TCSPC和時(shí)間門(TG)兩種。TCSPC利用快速秒表測(cè)量激發(fā)脈沖與探測(cè)熒光之間的時(shí)間差。使用高重復(fù)脈沖激發(fā)光激發(fā)樣品,在每一個(gè)脈沖周期內(nèi),最多激發(fā)熒光分子發(fā)出一個(gè)光子,然后記錄光子出現(xiàn)的時(shí)刻,并在該時(shí)刻記錄一個(gè)光子,再下一個(gè)脈沖周期內(nèi)也是相同的情況,經(jīng)過多次計(jì)數(shù)可以得到熒光光子隨時(shí)間的分布曲線。相似的,TG則探測(cè)不同時(shí)間窗口內(nèi)的熒光強(qiáng)度,通過曲線擬合得到熒光壽命。二是頻域測(cè)量,對(duì)連續(xù)激發(fā)光進(jìn)行振幅調(diào)制后,分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度也會(huì)受到振幅調(diào)制,兩個(gè)調(diào)制信號(hào)之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差,因此可以測(cè)量該相位差計(jì)算熒光壽命(圖2c,d)。

圖2 時(shí)域和頻域的FLIM測(cè)量方案原理示意圖:a、TCSPC方案;b、熒光光子到達(dá)時(shí)間直方圖;c、頻域測(cè)量示意圖;d、不同熒光壽命下,相位與頻率的關(guān)系

圖源:J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020)。 Fig.4

各種FLIM測(cè)量方案的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

兩類方法均存在各自的優(yōu)缺點(diǎn):

時(shí)域測(cè)量方法對(duì)于熒光強(qiáng)度較弱的樣品可以得到更好的時(shí)間分辨率和更高的信噪比,并且測(cè)量方法更為簡(jiǎn)單,易于掌握。

而當(dāng)樣品熒光強(qiáng)度較高時(shí),由于使用的電子器件處理速率限制,無法準(zhǔn)確提取熒光壽命信息。

對(duì)于頻域測(cè)量法,采集速度快,可以測(cè)量短時(shí)間內(nèi)的生物細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況,一般用于熒光強(qiáng)度足夠強(qiáng)的樣品中。

FLIM顯微裝置

目前為止,F(xiàn)LIM已被應(yīng)用在兩種顯微技術(shù)的裝置結(jié)構(gòu)上,分別為激光掃描共聚焦顯微技術(shù)(LSM)和寬場(chǎng)照明顯微技術(shù)(WFM)(圖3)。

LSM采用激光作為光源,成像過程需要對(duì)樣品進(jìn)行掃描。其中,作者主要介紹了共聚焦熒光壽命顯微成像技術(shù)(CLSM-FLIM)和多光子熒光壽命顯微成像技術(shù)(MP-FLIM)。

CLSM-FLIM利用針孔濾去焦平面外的背景噪聲,接著通過振鏡對(duì)樣品進(jìn)行二維平面上的掃描,配合目鏡對(duì)軸向的掃描,可以實(shí)現(xiàn)3D成像。

MP-FLIM則引入了多光子成像,以雙光子成像為例,若兩個(gè)光子能量值之和等于熒光分子基態(tài)S0與激發(fā)態(tài)S1的能級(jí)差,則熒光分子能同時(shí)吸收兩個(gè)光子,使電子被激發(fā)至S1能態(tài),并發(fā)生輻射躍遷產(chǎn)生熒光。MP-FLIM由于需要使用低光子能量、長(zhǎng)波段的光源,所以受散射影響更小,多被用于大腦等深度成像領(lǐng)域。

總的來說,LSM具光學(xué)層析能力,并且有更高的信噪比和空間分辨率。

與LSM不同,WFM采用平行光照明樣品,物鏡收集整個(gè)視場(chǎng)內(nèi)樣品發(fā)出的熒光并利用相機(jī)記錄。WFM-FLIM具有更快的成像速度,更小的光損傷,但是由于每個(gè)像素值均受其他像素位置的散射光影響,所以信噪比不如LSM?,F(xiàn)今,TCSPC、TG等時(shí)域熒光壽命檢測(cè)技術(shù)和頻域解調(diào)熒光壽命的技術(shù)均已被成功應(yīng)用于WFM,實(shí)現(xiàn)快速生物組織的成像。

圖3 LSM-FLIM與WFM-FFLIM結(jié)構(gòu)對(duì)比示意圖

圖源:J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020)。 Fig.5

FLIM生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

FLIM在生物學(xué)上的應(yīng)用根據(jù)熒光分子種類可以分為三種:分別為自發(fā)熒光FLIM、外源分子探針FLIM和FRET-FLIM。

自發(fā)熒光FLIM被廣泛應(yīng)用于非標(biāo)記生物成像領(lǐng)域。所謂自發(fā)熒光,即生物細(xì)胞本身便包含熒光分子,稱為內(nèi)源性熒光分子團(tuán)。FLIM通過對(duì)自發(fā)熒光分子團(tuán)(如NAD(P)H和FAD)熒光壽命的考察,可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝的監(jiān)測(cè)(圖4(a))。這種方案無需人為對(duì)樣品加入熒光試劑便可以發(fā)射熒光,有效減少了熒光染料對(duì)樣品的毒性、熒光分子與樣品的非特異性結(jié)合及染料對(duì)生理性能的干擾影響。

外源分子探針FLIM借助于外部熒光染料的注入以產(chǎn)生熒光(圖4(b))。如今,為了利用FLIM對(duì)物理?xiàng)l件(包括粘度、溫度、酸度和氧化作用)的敏感性,已經(jīng)開發(fā)出了許多適用于體內(nèi)和體外應(yīng)用的光學(xué)探針。

圖4 FLIM生物成像結(jié)果:a、小鼠乳腺腫瘤的NAD(P)H熒光壽命成像結(jié)果;b、小鼠的紅外熒光壽命成像結(jié)果

圖源:J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020)。 Fig9-10

FRET-FLIM,當(dāng)生物供體熒光分子與受體相互作用時(shí),會(huì)產(chǎn)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET),供體熒光淬滅,導(dǎo)致壽命減少(圖5)。FRET已用于探測(cè)蛋白質(zhì)中的構(gòu)象變化,蛋白質(zhì)之間的受體/配體相互作用、核酸鏈的雜交或分裂、膜脂質(zhì)相互作用和分布、蛋白酶的活性、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和許多其他現(xiàn)象。因此,借助于FRET,F(xiàn)LIM可更好地捕獲細(xì)胞外和亞細(xì)胞相互作用。

圖5 FRET-FLIM原理示意圖:a、供體受體相距較遠(yuǎn),無熒光淬滅;b、供體與受體相互靠近,發(fā)生熒光淬滅;c、受體的光漂白可以確認(rèn)供體熒光壽命的變化是由于FRET相互作用引起的

圖源:J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020)。 Fig.2

FLIM優(yōu)勢(shì)

作者主要分析了FLIM相比于熒光強(qiáng)度成像的優(yōu)勢(shì)。通過熒光強(qiáng)度成像可以獲得熒光分子的空間分布,較為直接和簡(jiǎn)便,但是當(dāng)熒光分子具有相似的頻譜特性,或是同樣的熒光分子在不同環(huán)境下時(shí),依賴強(qiáng)度進(jìn)行成像的方案便無法準(zhǔn)確反映信息。

與基于光強(qiáng)的成像方式不同,F(xiàn)LIM成像適用于測(cè)量熒光分子環(huán)境的變化,或是測(cè)量分子的運(yùn)動(dòng)情況(圖6)。其結(jié)果與熒光分子濃度無關(guān),且不受影響光強(qiáng)的光散射或是光吸收影響,可以精確測(cè)量熒光淬滅過程,對(duì)生物分子微環(huán)境進(jìn)行定量測(cè)量。

圖6 熒光強(qiáng)度成像與熒光壽命成像對(duì)比

圖源:Principles of Fluorescence Spectroscopy Chapter 22 Fig.22.1

FLIM技術(shù)與挑戰(zhàn)

在裝置上,F(xiàn)LIM搭建成本更高,并且為了準(zhǔn)確地?cái)M合熒光壽命,需要探測(cè)更多地光子,尤其是采用時(shí)域方案測(cè)量壽命時(shí),采集速度較慢,限制了FLIM在快速生物成像中的應(yīng)用。

在數(shù)據(jù)處理上,由于曲線擬合迭代過程的需求,計(jì)算成本較其他成像方案更高。

在成像原理上,熒光壽命受多種外界因素影響,這些因素包括分子相互作用、pH值、溫度和粘滯阻力等,很難對(duì)這些參數(shù)控制變量,使得測(cè)量熒光壽命存在交叉干擾問題。此外,與普通光學(xué)顯微技術(shù)類似,介質(zhì)光散射影響成像信噪比及空間分辨率,成像深度受到限制。

特別地,對(duì)于內(nèi)源性熒光分子,熒光量子效率較傳統(tǒng)染料低幾個(gè)數(shù)量級(jí),使得自發(fā)熒光FLIM的發(fā)展受到限制,此外,當(dāng)熒光壽命接近時(shí),很難將多種內(nèi)源性熒光分子區(qū)分。因此,實(shí)驗(yàn)中需要保持樣本之間參數(shù)的一致性,并需要對(duì)每天的對(duì)照樣本進(jìn)行成像。此外,可以利用藥物直接調(diào)節(jié)自發(fā)熒光分子的含量,例如已有研究表明杜醌可以調(diào)節(jié)NAD +與NADH的比例。

總結(jié)與展望

如今,F(xiàn)LIM已經(jīng)在系統(tǒng)裝置、熒光探針和數(shù)據(jù)處理算法等方面得到了較快的發(fā)展,這也使得FLIM在對(duì)細(xì)胞微環(huán)境成像和生物代謝監(jiān)測(cè)發(fā)揮出不可替代的作用。

結(jié)合多種先進(jìn)成像系統(tǒng),如雙光子成像、結(jié)構(gòu)光照明等,可進(jìn)一步提升FLIM的分辨率和測(cè)量精度。

另一方面,提升熒光壽命解調(diào)的算法性能,將壓縮感知、深度學(xué)習(xí)等熱點(diǎn)算法與FLIM結(jié)合,也同樣對(duì)FLIM的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。

總的來說,F(xiàn)LIM的發(fā)展很好地彌補(bǔ)了基于強(qiáng)度成像的問題,對(duì)生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)有著重要的意義。

責(zé)任編輯:PSY

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