熒光壽命顯微成像技術（FLIM）技術應用綜述

在生物體中，細胞內(nèi)的細胞間質(zhì)及體液成分構成了細胞生存的微環(huán)境。穩(wěn)定的微環(huán)境是保持細胞的正常增殖、分化、代謝以及其他功能活動最為重要的條件，細胞內(nèi)或細胞間的信息傳遞也離不開其所處的環(huán)境。

此外，在一些疾病的治療中，藥物分子與病變組織分子間相互作用，也會改變其微環(huán)境，可通過研究細胞或組織的微環(huán)境來評價藥物治療效果。

因此，對細胞微環(huán)境的高分辨率、高靈敏度探測成為了生物醫(yī)學的重要研究課題。

圖源：中科院長春光機所，Light學術出版中心，新媒體工作組

光學顯微技術可以將微米甚至納米量級的微小物質(zhì)及結構展現(xiàn)在我們面前，是我們打開微觀世界大門，觀察細胞組織和生物微環(huán)境的鑰匙。

若成像基于熒光發(fā)光團的熒光強度進行數(shù)據(jù)分析，則可稱之為熒光強度顯微技術。此類顯微技術通過顯微鏡的目鏡收集樣品各個位置的熒光強度，便可以得到生物組織的形貌，具有較髙成像空間分辨率，但受熒光團濃度的影響，其測量精度和定量分析能力都不理想。

幸運的是，在種類繁多的顯微技術中，熒光壽命顯微成像技術（FLIM）具有對生物大分子結構、動力學信息和分子環(huán)境等進行高分辨高精度測量的能力，因此其重要性日漸提升，被廣泛地應用于生物學研究及臨床診斷等領域。

近期，美國莫格里奇研究所的Melissa C.Skala【?拓展鏈接】課題組在Journal of Biomedical Optics發(fā)表了題為“Fluorescence lifetime imaging microscopy： fundamentals and advances in instrumentation， analysis， and applications”的綜述文章，詳細介紹了FLIM的發(fā)展，總結了時域、頻域兩類熒光壽命探測方案，考察了對細胞異質(zhì)性測量的圖像算法，最后列舉了FLIM在生物醫(yī)學上的實際應用。文章證實了FLIM在細胞微環(huán)境觀測領域的適用性，可被應用于疾病控制和藥物療效的監(jiān)測。

熒光壽命

分子包含多個能態(tài)S0、S1、S2和三重態(tài)T1，每個能態(tài)都包含多個精細的能級。正常情況下，大部分電子處在最低能態(tài)即基態(tài)S0的最低能級上，當分子被光束照射，會吸收光子能量，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1或S2上，在S2能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時間，便會通過內(nèi)轉換過程躍遷到S1上，而S1能態(tài)上的電子亦會在極短時間內(nèi)躍遷到S1的最低能級上，而這些電子會存在一段時間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài)，這個過程會釋放一個光子，即熒光。

此外，亦會有電子躍遷至三重態(tài)T1上，再由T1躍遷至基態(tài)，但是該過程發(fā)生幾率較熒光輻射幾率而言可以被忽略。

熒光的特性包含有：熒光激發(fā)和發(fā)射光譜、熒光強度、量子效率、熒光壽命等，其中，熒光壽命是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時間（納秒量級）。

圖1 熒光分子能級結構及躍遷示意圖

圖源：J. of Biomedical Optics， 25（7）， 071203 （2020）。 Fig.1

FLIM測量方案

分子的熒光壽命在幾納秒至幾百納秒之間，因此，測量熒光壽命需要極快響應時間的探測器。如今主要存在兩類方案：一是時域測量，由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1，接著測量熒光的發(fā)射幾率隨時間的變化（圖2a，b）。典型的時域測量方法有TCSPC和時間門（TG）兩種。TCSPC利用快速秒表測量激發(fā)脈沖與探測熒光之間的時間差。使用高重復脈沖激發(fā)光激發(fā)樣品，在每一個脈沖周期內(nèi)，最多激發(fā)熒光分子發(fā)出一個光子，然后記錄光子出現(xiàn)的時刻，并在該時刻記錄一個光子，再下一個脈沖周期內(nèi)也是相同的情況，經(jīng)過多次計數(shù)可以得到熒光光子隨時間的分布曲線。相似的，TG則探測不同時間窗口內(nèi)的熒光強度，通過曲線擬合得到熒光壽命。二是頻域測量，對連續(xù)激發(fā)光進行振幅調(diào)制后，分子發(fā)出的熒光強度也會受到振幅調(diào)制，兩個調(diào)制信號之間存在與熒光壽命相關的相位差，因此可以測量該相位差計算熒光壽命（圖2c，d）。

圖2 時域和頻域的FLIM測量方案原理示意圖：a、TCSPC方案；b、熒光光子到達時間直方圖；c、頻域測量示意圖；d、不同熒光壽命下，相位與頻率的關系

圖源：J. of Biomedical Optics， 25（7）， 071203 （2020）。 Fig.4

各種FLIM測量方案的優(yōu)缺點對比

兩類方法均存在各自的優(yōu)缺點：

時域測量方法對于熒光強度較弱的樣品可以得到更好的時間分辨率和更高的信噪比，并且測量方法更為簡單，易于掌握。

而當樣品熒光強度較高時，由于使用的電子器件處理速率限制，無法準確提取熒光壽命信息。

對于頻域測量法，采集速度快，可以測量短時間內(nèi)的生物細胞運動情況，一般用于熒光強度足夠強的樣品中。

FLIM顯微裝置

目前為止，F(xiàn)LIM已被應用在兩種顯微技術的裝置結構上，分別為激光掃描共聚焦顯微技術（LSM）和寬場照明顯微技術（WFM）（圖3）。

LSM采用激光作為光源，成像過程需要對樣品進行掃描。其中，作者主要介紹了共聚焦熒光壽命顯微成像技術（CLSM-FLIM）和多光子熒光壽命顯微成像技術（MP-FLIM）。

CLSM-FLIM利用針孔濾去焦平面外的背景噪聲，接著通過振鏡對樣品進行二維平面上的掃描，配合目鏡對軸向的掃描，可以實現(xiàn)3D成像。

MP-FLIM則引入了多光子成像，以雙光子成像為例，若兩個光子能量值之和等于熒光分子基態(tài)S0與激發(fā)態(tài)S1的能級差，則熒光分子能同時吸收兩個光子，使電子被激發(fā)至S1能態(tài)，并發(fā)生輻射躍遷產(chǎn)生熒光。MP-FLIM由于需要使用低光子能量、長波段的光源，所以受散射影響更小，多被用于大腦等深度成像領域。

總的來說，LSM具光學層析能力，并且有更高的信噪比和空間分辨率。

與LSM不同，WFM采用平行光照明樣品，物鏡收集整個視場內(nèi)樣品發(fā)出的熒光并利用相機記錄。WFM-FLIM具有更快的成像速度，更小的光損傷，但是由于每個像素值均受其他像素位置的散射光影響，所以信噪比不如LSM?，F(xiàn)今，TCSPC、TG等時域熒光壽命檢測技術和頻域解調(diào)熒光壽命的技術均已被成功應用于WFM，實現(xiàn)快速生物組織的成像。

圖3 LSM-FLIM與WFM-FFLIM結構對比示意圖

圖源：J. of Biomedical Optics， 25（7）， 071203 （2020）。 Fig.5

FLIM生物醫(yī)學應用

FLIM在生物學上的應用根據(jù)熒光分子種類可以分為三種：分別為自發(fā)熒光FLIM、外源分子探針FLIM和FRET-FLIM。

自發(fā)熒光FLIM被廣泛應用于非標記生物成像領域。所謂自發(fā)熒光，即生物細胞本身便包含熒光分子，稱為內(nèi)源性熒光分子團。FLIM通過對自發(fā)熒光分子團（如NAD（P）H和FAD）熒光壽命的考察，可以實現(xiàn)細胞代謝的監(jiān)測（圖4（a））。這種方案無需人為對樣品加入熒光試劑便可以發(fā)射熒光，有效減少了熒光染料對樣品的毒性、熒光分子與樣品的非特異性結合及染料對生理性能的干擾影響。

外源分子探針FLIM借助于外部熒光染料的注入以產(chǎn)生熒光（圖4（b））。如今，為了利用FLIM對物理條件（包括粘度、溫度、酸度和氧化作用）的敏感性，已經(jīng)開發(fā)出了許多適用于體內(nèi)和體外應用的光學探針。

圖4 FLIM生物成像結果：a、小鼠乳腺腫瘤的NAD（P）H熒光壽命成像結果；b、小鼠的紅外熒光壽命成像結果

圖源：J. of Biomedical Optics， 25（7）， 071203 （2020）。 Fig9-10

FRET-FLIM，當生物供體熒光分子與受體相互作用時，會產(chǎn)生熒光能量共振轉移（FRET），供體熒光淬滅，導致壽命減少（圖5）。FRET已用于探測蛋白質(zhì)中的構象變化，蛋白質(zhì)之間的受體/配體相互作用、核酸鏈的雜交或分裂、膜脂質(zhì)相互作用和分布、蛋白酶的活性、染色質(zhì)結構和許多其他現(xiàn)象。因此，借助于FRET，F(xiàn)LIM可更好地捕獲細胞外和亞細胞相互作用。

圖5 FRET-FLIM原理示意圖：a、供體受體相距較遠，無熒光淬滅；b、供體與受體相互靠近，發(fā)生熒光淬滅；c、受體的光漂白可以確認供體熒光壽命的變化是由于FRET相互作用引起的

圖源：J. of Biomedical Optics， 25（7）， 071203 （2020）。 Fig.2

FLIM優(yōu)勢

作者主要分析了FLIM相比于熒光強度成像的優(yōu)勢。通過熒光強度成像可以獲得熒光分子的空間分布，較為直接和簡便，但是當熒光分子具有相似的頻譜特性，或是同樣的熒光分子在不同環(huán)境下時，依賴強度進行成像的方案便無法準確反映信息。

與基于光強的成像方式不同，F(xiàn)LIM成像適用于測量熒光分子環(huán)境的變化，或是測量分子的運動情況（圖6）。其結果與熒光分子濃度無關，且不受影響光強的光散射或是光吸收影響，可以精確測量熒光淬滅過程，對生物分子微環(huán)境進行定量測量。

圖6 熒光強度成像與熒光壽命成像對比

圖源：Principles of Fluorescence Spectroscopy Chapter 22 Fig.22.1

FLIM技術與挑戰(zhàn)

在裝置上，F(xiàn)LIM搭建成本更高，并且為了準確地擬合熒光壽命，需要探測更多地光子，尤其是采用時域方案測量壽命時，采集速度較慢，限制了FLIM在快速生物成像中的應用。

在數(shù)據(jù)處理上，由于曲線擬合迭代過程的需求，計算成本較其他成像方案更高。

在成像原理上，熒光壽命受多種外界因素影響，這些因素包括分子相互作用、pH值、溫度和粘滯阻力等，很難對這些參數(shù)控制變量，使得測量熒光壽命存在交叉干擾問題。此外，與普通光學顯微技術類似，介質(zhì)光散射影響成像信噪比及空間分辨率，成像深度受到限制。

特別地，對于內(nèi)源性熒光分子，熒光量子效率較傳統(tǒng)染料低幾個數(shù)量級，使得自發(fā)熒光FLIM的發(fā)展受到限制，此外，當熒光壽命接近時，很難將多種內(nèi)源性熒光分子區(qū)分。因此，實驗中需要保持樣本之間參數(shù)的一致性，并需要對每天的對照樣本進行成像。此外，可以利用藥物直接調(diào)節(jié)自發(fā)熒光分子的含量，例如已有研究表明杜醌可以調(diào)節(jié)NAD +與NADH的比例。

總結與展望

如今，F(xiàn)LIM已經(jīng)在系統(tǒng)裝置、熒光探針和數(shù)據(jù)處理算法等方面得到了較快的發(fā)展，這也使得FLIM在對細胞微環(huán)境成像和生物代謝監(jiān)測發(fā)揮出不可替代的作用。

結合多種先進成像系統(tǒng)，如雙光子成像、結構光照明等，可進一步提升FLIM的分辨率和測量精度。

另一方面，提升熒光壽命解調(diào)的算法性能，將壓縮感知、深度學習等熱點算法與FLIM結合，也同樣對FLIM的發(fā)展起著至關重要的作用。

總的來說，F(xiàn)LIM的發(fā)展很好地彌補了基于強度成像的問題，對生物醫(yī)學檢測有著重要的意義。

責任編輯：PSY