基于邊合成邊測(cè)序技術(shù)的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

基于邊合成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis，SBS）技術(shù)，Illumina HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，能夠產(chǎn)出大量的高質(zhì)量Reads，測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)出的這些Reads或堿基稱為原始數(shù)據(jù)（Raw Data），其大部分堿基質(zhì)量打分能達(dá)到或超過(guò)Q30。Raw Data通常以FASTQ格式提供，每個(gè)測(cè)序樣品的Raw Data包括兩個(gè)FASTQ文件，分別包含所有cDNA片段兩端測(cè)定的Reads。

FASTQ格式文件示意圖如下：

FASTQ格式文件示意圖

注：FASTQ文件中通常每4行對(duì)應(yīng)一個(gè)序列單元：第一行以@開(kāi)頭，后面接著序列標(biāo)識(shí)（ID）以及其它可選的描述信息；第二行為堿基序列，即Reads；第三行以“+”開(kāi)頭，后面接著可選的描述信息；第四行為Reads每個(gè)堿基對(duì)應(yīng)的質(zhì)量打分編碼，長(zhǎng)度必須和Reads的序列長(zhǎng)度相同。

測(cè)序堿基質(zhì)量值

堿基質(zhì)量值（Quality Score或Q-score）是堿基識(shí)別（Base Calling）出錯(cuò)的概率的整數(shù)映射。通常使用的Phred堿基質(zhì)量值公式為：

公式中，P為堿基識(shí)別出錯(cuò)的概率。下表給出了堿基質(zhì)量值與堿基識(shí)別出錯(cuò)的概率的對(duì)應(yīng)關(guān)系：

表1 堿基質(zhì)量值與堿基識(shí)別出錯(cuò)的概率的對(duì)應(yīng)關(guān)系表

堿基質(zhì)量值越高表明堿基識(shí)別越可靠，堿基測(cè)錯(cuò)的可能性越小。比如，對(duì)于堿基質(zhì)量值為Q20的堿基識(shí)別，100個(gè)堿基中有1個(gè)會(huì)識(shí)別出錯(cuò)；對(duì)于堿基質(zhì)量值為Q30的堿基識(shí)別，1,000個(gè)堿基中有1個(gè)會(huì)識(shí)別出錯(cuò)；Q40表示10,000個(gè)堿基中才有1個(gè)會(huì)識(shí)別出錯(cuò)。

以測(cè)序循環(huán)為單位，對(duì)單個(gè)樣品所有Reads平行測(cè)序的堿基質(zhì)量值做分布圖，可以查看單個(gè)樣品各個(gè)測(cè)序循環(huán)及整體的測(cè)序質(zhì)量。

堿基質(zhì)量值分布圖

注：橫坐標(biāo)為測(cè)序堿基在Reads上的位置，縱坐標(biāo)為堿基質(zhì)量值。顏色深淺表示堿基比重，顏色越深，說(shuō)明該位置測(cè)定的堿基中為對(duì)應(yīng)質(zhì)量值的堿基所占的比重越大，反之亦然。

測(cè)序質(zhì)量控制

FASTQ文件中測(cè)序Reads需要與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，定位cDNA片段在基因組或基因上的位置。在序列比對(duì)之前，首先需要確保這些Reads有足夠高的質(zhì)量，以保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確。測(cè)序質(zhì)量控制方式如下：

(1) 去除測(cè)序接頭以及引物序列；

(2) 過(guò)濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。

經(jīng)過(guò)上述一系列的質(zhì)量控制之后得到的高質(zhì)量Reads或堿基，稱為Clean Data。Clean Data同樣以FASTQ格式提供。

測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

某項(xiàng)目各樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)見(jiàn)下表：

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表

注：Samples：樣品信息單樣品名稱；ID：樣品編號(hào)；Read Number：Clean Data中pair-end Reads（雙末端測(cè)序）總數(shù)；Base Number：Clean Data總堿基數(shù)；GC Content：Clean Data GC含量，即Clean Data中G和C兩種堿基占總堿基的百分比；%≥Q30：Clean Data質(zhì)量值大于或等于30的堿基所占的百分比。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)

獲得Clean Reads后，將其與參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測(cè)序樣品特有的序列特征信息。

TopHat2是一個(gè)高效的序列比對(duì)軟件。它以高通量Reads比對(duì)軟件Bowtie為基礎(chǔ)，將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序Reads比對(duì)到基因組上，然后通過(guò)分析比對(duì)結(jié)果識(shí)別外顯子之間的剪接點(diǎn)（Splicing Junction）。這不僅為可變剪接分析提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，還能夠使更多的Reads比對(duì)到參考基因組，提高了測(cè)序數(shù)據(jù)的利用率。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中，只有比對(duì)到參考基因組上的數(shù)據(jù)才能用于后續(xù)分析。因此，將比對(duì)到指定的參考基因組上的Reads稱為Mapped Reads，對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)稱為Mapped Data。

比對(duì)效率統(tǒng)計(jì)

比對(duì)效率指Mapped Reads占Clean Reads的百分比，是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)利用率的最直接體現(xiàn)。比對(duì)效率除了受數(shù)據(jù)測(cè)序質(zhì)量影響外，還與指定的參考基因組組裝的優(yōu)劣、參考基因組與測(cè)序樣品的生物學(xué)分類關(guān)系遠(yuǎn)近（亞種）有關(guān)。因此，通過(guò)比對(duì)效率，可以評(píng)估所選參考基因組組裝是否能滿足信息分析的需求，及后期數(shù)據(jù)分析的可靠性。

各樣品測(cè)序數(shù)據(jù)與所選參考基因組的序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)下表：

表3 Clean Data與參考基因組比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

注：ID：樣品編號(hào)；Total Reads：Clean Reads數(shù)目，按單端計(jì)；Mapped Reads：比對(duì)到參考基因組上的Reads數(shù)目；Mapped Ratio：比對(duì)到參考基因組上的Reads在Clean Reads中占的百分比；Uniq Mapped Reads：比對(duì)到參考基因組唯一位置的Reads數(shù)目；Uniq Mapped Ratio：比對(duì)到參考基因組唯一位置的Reads在Clean Reads中占的百分比。

比對(duì)結(jié)果作圖

將比對(duì)到不同染色體上Reads進(jìn)行位置分布統(tǒng)計(jì)，繪制Mapped Reads在所選參考基因組上的覆蓋深度分布圖。

樣品T01的Mapped Reads在參考基因組部分染色體上的覆蓋深度分布圖如下：

Mapped Reads在參考基因組上的位置及覆蓋深度分布圖

注：橫坐標(biāo)為染色體位置；縱坐標(biāo)為覆蓋深度以2為底的對(duì)數(shù)值，以10kb作為區(qū)間單位長(zhǎng)度，劃分染色體成多個(gè)小窗口（Window），統(tǒng)計(jì)落在各個(gè)窗口內(nèi)的Mapped Reads作為其覆蓋深度。

理論上，來(lái)自成熟mRNA的Reads應(yīng)該比對(duì)到外顯子區(qū)。但是，由于以下原因一部分Reads會(huì)比對(duì)到內(nèi)含子區(qū)和基因間區(qū)：

(1) 樣品提取時(shí)將含有Ploy(A)尾而內(nèi)含子沒(méi)有切除完全的mRNA（即mRNA前體）提出，使得來(lái)自內(nèi)含子片段的Reads比對(duì)到了內(nèi)含子區(qū)；

(2) 基因組注釋錯(cuò)誤，原來(lái)為外顯子的區(qū)域注釋成了內(nèi)含子區(qū)，或者相反；

(3) 基因組注釋水平低，對(duì)于使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行的基因組注釋，由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不能遍歷所有的時(shí)間和空間點(diǎn)，使得用于注釋的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中不表達(dá)或低表達(dá)的基因剛好在該項(xiàng)目的樣品中檢測(cè)到較高豐度時(shí)，來(lái)自這類基因的Reads就比對(duì)到了被注釋的基因間區(qū)，這也是新基因和新轉(zhuǎn)錄本發(fā)掘的基礎(chǔ)之一；

(4) 測(cè)序樣品與參考基因組存在差異，比如測(cè)序樣品中突變形成新的轉(zhuǎn)錄組起始位點(diǎn)形成樣品特有的新基因，或者剪接位點(diǎn)差異形成新的轉(zhuǎn)錄本，這也是新轉(zhuǎn)錄本發(fā)掘的基礎(chǔ)之一。

統(tǒng)計(jì)Mapped Reads在指定的參考基因組不同區(qū)域（外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)）的數(shù)目，繪制基因組不同區(qū)域上各樣品Mapped Reads的分布直方圖，如下：

基因組不同區(qū)域Reads分布直方圖

注：圖中每個(gè)直方柱表示一個(gè)樣品，粉色區(qū)域?yàn)橥怙@子區(qū)、綠色區(qū)域?yàn)榛蜷g區(qū)、藍(lán)色區(qū)域?yàn)閮?nèi)含子區(qū)，區(qū)域的高度表示比對(duì)到該區(qū)域的Mapped Reads在所有Mapped Reads中所占的百分比。
編輯：hfy