SHG 圖像可以通過傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光顯微鏡（TPM）獲得？

在非線性光學(xué)顯微鏡中，二倍頻（SHG）成像通常用于觀測內(nèi)源性纖維狀結(jié)構(gòu)，且 SHG 的強(qiáng)度很大程度上取決于入射光束的偏振方向與目標(biāo)分子取向軸之間的相對(duì)角度。因此，基于偏振的 SHG 成像（P－SHG），可通過分析 SHG 信號(hào)強(qiáng)度與入射光束的偏振態(tài)之間的函數(shù)關(guān)系，來獲得目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)信息。其現(xiàn)在已用作醫(yī)學(xué)和生物學(xué)分析的重要工具。

簡單的 SHG 圖像可以通過傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光顯微鏡（TPM）獲得。大多數(shù) TPM 系統(tǒng)仍采用基于運(yùn)動(dòng)鏡面的單束掃描方法，其時(shí)間分辨率取決于鏡面的物理移動(dòng)速度。為了實(shí)現(xiàn)更高速的成像，TPM 系統(tǒng)還可以采用多束掃描的方法（圖 1A），其中之一便是利用轉(zhuǎn)盤掃描單元。該單元由共軸的微透鏡轉(zhuǎn)盤和針孔轉(zhuǎn)盤構(gòu)成，兩個(gè)轉(zhuǎn)盤上的微透鏡和針孔一一對(duì)應(yīng)。

激光在通過微透鏡轉(zhuǎn)盤時(shí)，波前會(huì)覆蓋多個(gè)微透鏡，不同微透鏡將波前各部分聚焦到不同的位置，并穿過對(duì)應(yīng)的針孔，形成多個(gè)微光束。這些微光束打到樣品上，可同時(shí)激發(fā)多個(gè)信號(hào)。這些信號(hào)沿顯微鏡系統(tǒng)返回并再次穿過針孔，最后被兩個(gè)轉(zhuǎn)盤之間的二向色鏡反射到檢測裝置中。然而，常規(guī)使用的鎖模鈦寶石激光器作為光源能量不足，限制了激發(fā)光束的數(shù)量，導(dǎo)致使用轉(zhuǎn)盤掃描單元的 TPM （TPM－SD） 的有效視場 （FOV） 很小。

Ai Goto 等人想通過 TPM－SD 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高速的 P－SHG 成像，并保證大的 FOV，故在 TPM－SD 系統(tǒng)中引入了峰值功率更高的基于 Yb 的激光光源。

圖 1 是他們開發(fā)的 TPM－SD 系統(tǒng)示意圖。該系統(tǒng)光源為基于 Yb 的激光器，產(chǎn)生的飛秒脈沖中心波長為 1042 nm、平均功率 4 W、脈寬 300 fs，重復(fù)頻率 10 MHz。系統(tǒng)首先通過半波片和格蘭激光偏振器來調(diào)節(jié)激光功率，接著通過擴(kuò)束器進(jìn)行擴(kuò)束，擴(kuò)束后的光束被引入到轉(zhuǎn)盤掃描單元中，接著從掃描單元出來的多個(gè)微光束通過水浸物鏡被聚焦在樣品的多個(gè)點(diǎn)上。為了調(diào)整光束在物鏡處的偏振態(tài)，激發(fā)光束的光路上放置了一個(gè)半波片和一個(gè)四分之一波片。

為了測量樣品上入射光束的偏振態(tài)，在物鏡后端放置了一個(gè)線性偏振膜。在這項(xiàng)研究中，他們使用了圓偏振光（圖 1B；橢圓度 0．95）和 4 種線偏振光束（圖 1C－F；橢圓度 0．2－0．3）。以 FOV 的水平軸為基準(zhǔn)，將橫向偏振角設(shè)置為 0、45、90 和 135°。物鏡收集到的熒光或 SHG 光通過針孔轉(zhuǎn)盤，被二向色鏡反射至偏振分束器。偏振分束器將信號(hào)分離為一對(duì)偏振分辨信號(hào)，它們被放大倍數(shù)為×1．2 的中繼透鏡分別聚焦在電子倍增 CCD 相機(jī)的不同方形檢測區(qū)域上，從而同時(shí)獲取一對(duì)矩形圖像。軸向掃描是通過壓電驅(qū)動(dòng)器實(shí)現(xiàn)的。

總之，該組通過 TPM－SD 系統(tǒng)，開發(fā)了一種高速的偏振分辨成像方法。他們使用該系統(tǒng)對(duì)固定的小鼠皮膚樣品和骨骼肌樣品（離體）以及活體小鼠的骨骼肌進(jìn)行了成像，證明了該系統(tǒng)能以 56 Hz 的時(shí)間分辨率對(duì)體內(nèi)組織成像，獲取膠原纖維的結(jié)構(gòu)信息。

圖 1 （A） TPM－SD 系統(tǒng)；（B–F） 通過調(diào)整 HWP 和 QWP 的位置，改變?nèi)肷涔饷}沖在樣品上的偏振態(tài)。

非線性成像技術(shù)的優(yōu)化，除了基于圖像獲取模式的優(yōu)化，還可以從先進(jìn)的圖像處理算法入手。發(fā)展圖像的實(shí)時(shí)分析工具，以幫助病理學(xué)家快速表征組織特性，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的病癥診斷，具有極大的推動(dòng)醫(yī)學(xué)發(fā)展的潛力。目前，用于自動(dòng)提取疾病特征的用戶獨(dú)立算法引起了越來越多的關(guān)注。2019 年，Riccardo Scodellaro 等人開發(fā)了一種針對(duì) P－SHG 的圖像處理方法——μMAPPS（Microscopic Multiparametric Analysis by Phasor projection of Polarization－dependent SHG signal）。其原理是對(duì)每個(gè)像素的隨入射光偏振態(tài)變化的 SHG 信號(hào)（）進(jìn)行二維相量分析，從中分析出各像素對(duì)應(yīng)膠原蛋白纖維的平均取向角 （θF）和極化率各向異性參數(shù)（γ，極化率張量χ（2）的非對(duì)角線和對(duì)角線元素的比），并依此獲得組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中膠原蛋白的微結(jié)構(gòu)信息。

該組的最終目標(biāo)為無人員操作，全自動(dòng)化，基于μMAPPS 算法的病理學(xué)診斷：通過區(qū)分不同組織中不同的膠原蛋白結(jié)構(gòu)，來區(qū)分正常組織和癌變組織。具體方法為，先通過μMAPPS 重構(gòu)每個(gè)像素的和信息，接著，將整個(gè)圖像劃分為包含大量感興趣區(qū)域（ROI）的網(wǎng)格，對(duì)每個(gè) ROI 的所有像素應(yīng)用聚類算法，將和類似的像素歸為一類（簇），至此，每個(gè) ROI 的像素都被分為了數(shù)十個(gè)簇，然后，基于不同 ROI 中不同的分簇，定義一組參數(shù) （p 參數(shù)：簇?cái)?shù)（NC），簇元素比（CER，每個(gè)簇與最大像素?cái)?shù)量的簇，所含像素?cái)?shù)量之比），和熵（S））， 以量化各 ROI 中膠原蛋白結(jié)構(gòu)的無序性。

最后，以所有 ROI 參數(shù)的平均值為基準(zhǔn)，將各 ROI 區(qū)分為正常組織或癌變組織，并對(duì)應(yīng)投影回原圖像中。圖 2 是基于熵值的腫瘤邊緣分割結(jié)果。該組通過研究 CT26（結(jié)腸癌）和 4T1（乳腺癌）兩種癌癥模型，測試了該方法自動(dòng)區(qū)分腫瘤和健康組織區(qū)域的準(zhǔn)確率，并證明熵是在同一組織類型內(nèi)，區(qū)分腫瘤與健康區(qū)域，判別腫瘤邊緣的最佳參數(shù)。

圖 2 （A， B） 基于熵（S）的感興趣區(qū)域（ROI）的分析結(jié)果。每個(gè) 150×150 ？m2 的 ROI（A， B）都按照?qǐng)D例進(jìn)行了顏色編碼，以表示 CT26 的癌變區(qū)域（A）和 4T1 的癌變區(qū)域（B），及其中檢索到的熵值。（C， D） 將 ROI 分析結(jié)果反投影到 CT26 （C）和 4T1 （D） 腫瘤模型的原圖像平面，并分割出癌變部分的圖像。紅色虛線表示腫瘤和正常組織的邊界。
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