芯片制備方法 - 生物芯片

　　芯片制備方法

　　包括原位合成和預合成后點樣。

　　原位合成：適用于寡核苷酸，通過光引導蝕刻技術。已有P53、P450，BRCAI/BRCA2 等基因突變的基因芯片。

　　預合成后點樣：是將提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因組DAN等通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。該技術優(yōu)點在于相對簡易低廉，被國內(nèi)外廣泛使用。

　　接觸式點樣：是指打印針從多孔板取出樣品后直接打印在芯片上。打印時針頭與芯片接觸。優(yōu)點是探針密度高，通常一平方厘米可打印2500個探針。缺點是定量準確性及重現(xiàn)性不太好。

　　非接觸式點樣：針頭與芯片保持一定距離。優(yōu)點是定量準確重現(xiàn)性好，缺點是噴印的斑點大，密度低。通常一平方厘米只有400點。但是日本佳能公司 能把噴印點直徑大小由150-100μm降到30-25μm。可將哺乳動物整個基因組DNA點陣于一張芯片上成為可能。

　　使用壽命

　　按照美國生物芯片制備標準，使用壽命約為10-15年。

　　應用領域

　　最大用途在于疾病檢測

　　基因表達水平的檢測

　　用基因芯片進行的表達水平檢測可自動、快速地檢測出成千上萬個基因的表達情況。謝納（M.Schena） 等用人外周血淋巴細胞的cDNA文庫構建一個代表1046個基因的cDNA微陣列，來檢測體外培養(yǎng)的T細胞對熱休克反應后不同基因表達的差異，發(fā)現(xiàn)有5個基因在處理后存在非常明顯的高表達，11個基因中度表達增加和6個基因表達明顯抑制。該結果還用熒光素交換標記對照和處理組及RNA印跡方法證實。在HGP完成之后，用于檢測在不同生理、病理條件下的人類所有基因表達變化的基因組芯片為期不遠了。

　　基因診斷

　　從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術。例如Affymetrix公司，把p53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成p53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如，Heller等構建了96個基因的cDNA微陣，用于檢測分析風濕性關節(jié)炎（RA）相關的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應用。

　　藥物篩選

　　利用基因芯片分析用藥前后機體的不同組織、器官基因表達的差異。如果再cDNA表達文庫得到的肽庫制作肽芯片，則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質。還有，利用RNA、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復雜的空間結構，更有利與靶分子相結合，可將核酸庫中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白孵育，形成蛋白質-RNA或蛋白質-DNA復合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此芯片技術和RNA庫的結合在藥物篩選中將得到廣泛應用。在尋找HIV藥物中，Jellis等用組合化學合成及DNA芯片技術篩選了654536種硫代磷酸八聚核苷酸，并從中確定了具有XXG4XX樣結構的抑制物，實驗表明，這種篩選物對HIV感染細胞有明顯阻斷作用。生物芯片技術使得藥物篩選，靶基因鑒別和新藥測試的速度大大提高，成本大大降低。

　　個體化醫(yī)療

　　臨床上，同樣藥物的劑量對病人甲有效可能對病人乙不起作用，而對病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應差異很大。這主要是由于病人遺傳學上存在差異（單核苷酸多態(tài)性，SNP），導致對藥物產(chǎn)生不同的反應。如果利用基因芯片技術對患者先進行診斷，再開處方，就可對病人實施個體優(yōu)化治療。另一方面，在治療中，很多同種疾病的具體病因是因人而異的，用藥也應因人而異。例如乙肝有較多亞型，HBV基因的多個位點如S、P及C基因區(qū)易發(fā)生變異。若用乙肝病毒基因多態(tài)性檢測芯片每隔一段時間就檢測一次，這對指導用藥防止乙肝病毒耐藥性很有意義。

　　測序

　　基因芯片利用固定探針與樣品進行分子雜交產(chǎn)生的雜交圖譜而排列出待測樣品的序列，這種測定方法快速而具有十分誘人的前景。研究人員用含135000個寡核苷酸探針的陣列測定了全長為16.6kb的人線粒體基因組序列，準確率達99%。用含有48000個寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異，結果發(fā)現(xiàn)在外顯子約3.4kb長度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之間，提示了二者在進化上的高度相似性。

　　生物信息學研究

　　人類基因組計劃是人類為了認識自己而進行的一項偉大而影響深遠的研究計劃。目前的問題是面對大量的基因或基因片斷序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正體現(xiàn)HGP計劃的價值--破譯人類基因這部天書。后基因組計劃、蛋白組計劃、疾病基因組計劃等概念就是為實現(xiàn)這一目標而提出的。生物信息學將在其中扮演至關重要的角色。生物芯片技術就是為實現(xiàn)這一環(huán)節(jié)而建立的，使對個體生物信息進行高速、并行采集和分析成為可能，必將成為未來生物信息學研究中的一個重要信息采集和處理平臺，成為基因組信息學研究的主要技術支撐。生物芯片作為生物信息學的主要技術支撐和操作平臺，其廣闊的發(fā)展空間就不言而喻。

　　在實際應用方面，生物芯片技術可廣泛應用于疾病診斷和治療、藥物基因組圖譜、藥物篩選、中藥物種鑒定、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防等許多領域。它將為人類認識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發(fā)中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺，這從中國99年3月國家科學技術部剛起草的《醫(yī)藥生物技術“十五”及2015年規(guī)劃》中便可見一斑：規(guī)劃所列十五個關鍵技術項目中，就有八個項目（基因組學技術、重大疾病相關基因的分離和功能研究、基因藥物工程、基因治療技術、生物信息學技術、組合生物合成技術、新型診斷技術、蛋白質組學和生物芯片技術）要使用生物芯片。生物芯片技術被單列作為一個專門項目進行規(guī)劃?？傊镄酒夹g在醫(yī)學、生命科學、藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境科學等凡與生命活動有關的領域中均具有重大的應用前景。